[发明专利]一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液以及定向诱导方法和应用

权利要求书

1.一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液，其特征在于，当待诱导细胞为人胚胎干细胞时，所述培养液成分为：体积百分比为85%-90%的基础培养基，体积百分比为10%-15%的血清替代物、0.1 mM非必须氨基酸、2.0 mM GlutaMAX™ 添加剂、0.1mM β-巯基乙醇、0.25-1.0mM N-乙酰半胱氨酸、100-200ng/ml重组人骨形态发生蛋白4、50-100ng/ml重组人干细胞因子、50ng/ml重组人白血病抑制因子、50ng/ml重组人表皮生长因子、10 μM ROCK抑制剂；

当待诱导细胞为人多能诱导干细胞时，所述培养液成分为：体积百分比为85%-90%的基础培养基，体积百分比为10%-15%的血清替代物、0.1 mM非必须氨基酸、2.0 mM GlutaMAX™添加剂、0.1mM β-巯基乙醇、0.5-1.0mM N-乙酰半胱氨酸、100-200ng/ml重组人骨形态发生蛋白4、50-100ng/ml重组人干细胞因子、50ng/ml重组人白血病抑制因子、50ng/ml重组人表皮生长因子、10 μM ROCK抑制剂。

2.根据权利要求1所述的体外诱导人类原始生殖细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基选自GMEM培养基；所述血清替代物为Knockout^TM SR。

3.根据权利要求1所述的体外诱导人类原始生殖细胞培养液，其特征在于，所述N-乙酰半胱氨酸用基础培养基溶解制成浓储液后，与其他成分混匀。

4.根据权利要求3所述的体外诱导人类原始生殖细胞培养液，其特征在于，所述浓储液浓度为200mM。

5.一种基于权利要求1所述体外诱导人类原始生殖细胞培养液的定向诱导分化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1：将人胚胎干细胞消化成单细胞，使用含有体积百分比为85%-90%的基础培养基，体积百分比为10%-15%的血清替代物，0.1mMβ-巯基乙醇，50ng/ml重组人Wnt3a蛋白，40ng/ml激活素A的培养基重悬后，进行预诱导，得到新生类中胚层细胞；

S2：将S1得到的新生类中胚层细胞用权利要求1所述培养液重悬，得到重悬液，将重悬液种于低粘附细胞板中在5%CO₂、37℃培养箱中继续培养，培养1-3天后，将培养液更换为不含ROCK抑制剂的培养液继续培养2-4天，直至培养得到拟胚体； S2中所述不含ROCK抑制剂的培养液成分为：体积百分比为85%-90%的GMEM培养基，体积百分比为10%-15%的血清替代物、0.1 mM非必须氨基酸、2.0 mM GLUTAMAX™ 添加剂、0.1mMβ-巯基乙醇、0.25-1.0mM N-乙酰半胱氨酸、100-200ng/ml重组人骨形态发生蛋白4、50-100ng/ml重组人干细胞因子、50ng/ml重组人白血病抑制因子、50ng/ml重组人表皮生长因子；

S3：从S2得到的拟胚体中分离得到人类原始生殖细胞。