[发明专利]一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液以及定向诱导方法和应用

说明书

本发明涉及干细胞诱导分化培养技术领域，具体为一种体外高效人类原始生殖细胞体外诱导培养液，选用GMEM(Glasgow’s MEM)，含有血清替代物、非必须氨基酸、GlutaMAX^TM添加剂、β‑巯基乙醇、N‑乙酰半胱氨酸、重组人骨形态发生蛋白4、重组人干细胞因子、重组人白血病抑制因子、重组人表皮生长因子、ROCK抑制剂。本发明的体外诱导培养基所诱导产生的人原始生殖细胞样细胞有较高的比例，相比于传统体外诱导培养基的比例呈翻倍增加趋势，并且不改变原始生殖细胞的转录组水平特性。

技术领域

本发明涉及干细胞诱导分化培养技术领域，特别涉及一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液以及定向诱导方法和应用。

背景技术

不孕不育已经成为世界上一个重要的健康问题，在所有不孕症的比例中，存在相当比例的生殖细胞分化成熟障碍的患者。由于原始生殖细胞的发现使得生殖细胞发育障碍类疾病研究有了新的研究方向，原始生殖细胞也成为了体外诱导减数分裂发生模型研究中所必须的种子细胞。

原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs) 是分化为精子和卵子的起始细胞，具有较高的多能性。人PGCs 最早出现在第四周(约 E24)，在外胚层卵黄囊壁附近的尿囊中形成，同小鼠PGCs 胚胎期第8天的位置相似，此时人PGCs 完成特化。特化后的人PGCs开始迁移，期间PGCs 不断增殖并发生一系列的表观遗传修饰的动态变化，其中包括 DNA甲基化和组蛋白修饰等。在第六周初(约胚胎期第37天), 人PGCs 迁移并植入早期生殖嵴,此时的PGCs 已初步分化，分化后的 hPGCs 与原始性腺相互作用进入配子发育阶段。

原始生殖细胞作为体外诱导减数分裂发生模型研究中所必须的种子细胞，需要将其在体外进行诱导后大量获得，而如何在体外大规模诱导培养原始生殖细胞样细胞成为了干细胞和生殖医学领域研究的重点。

现有的诱导原始生殖细胞样细胞的常用体系为含有15%血清替代物的GMEM培养基(GK15)，但经过该诱导培养体系所得的原始生殖细胞样细胞比例低下，诱导成本较高，难以一次性获得大量的目的细胞。

因此急需提供一种可增强将人多能干细胞包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞定向诱导分化为原始生殖细胞样细胞诱导比例的培养基，以及可行的定向诱导方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液，该体外诱导人类原始生殖细胞培养液能够在不改变转录组水平的前提下大大提高将人胚胎干细胞或人多能诱导干细胞定向诱导分化为原始生殖细胞样细胞的诱导比例，弥补不可改变的体外培养条件的不足，为研究生殖细胞谱系发育和体外减数分裂发生等模型提供大量高质量的种子细胞成为可能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种体外诱导人类原始生殖细胞培养液，所述培养液成分包括：在基础培养基中，添加血清替代物、非必须氨基酸、GlutaMAX™ 添加剂、β-巯基乙醇、N-乙酰半胱氨酸、重组人骨形态发生蛋白4、重组人干细胞因子、重组人白血病抑制因子、重组人表皮生长因子、ROCK抑制剂。

进一步的，所述基础培养基选自GMEM培养基；所述血清替代物为Knockout^TMSR（主要成为为AlbuMAX）。

进一步的，所述培养液包括：体积百分比为85%-90%的基础培养基，体积百分比为10%-15%的血清替代物、0.1 mM非必须氨基酸、2.0 mM GlutaMAX™ 添加剂、0.1mM β-巯基乙醇、0.25-1.0mM N-乙酰半胱氨酸、100-200ng/ml重组人骨形态发生蛋白4、50-100ng/ml重组人干细胞因子、50ng/ml重组人白血病抑制因子、50ng/ml重组人表皮生长因子、10 μMROCK抑制剂。

进一步的，所述N-乙酰半胱氨酸用基础培养基溶解制成浓储液后，与其他成分混匀；优选的，所述浓储液浓度为200mM。