[发明专利]用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法

说明书

本发明提出了用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法，该组合物包括引物和探针，所述引物包括：上游引物序列：5’‑CATCTCACAGAGTTACATCTTTCC‑3’(SEQ ID NO:2)，下游引物序列：5’‑CTTTTTCACCATAGCCCTCTA‑3’(SEQ ID NO:3)；所述探针包括如下序列：5’‑CCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGT‑3’(SEQ ID NO:4)。利用本发明提出的组合物可以排除CHO细胞、大肠杆菌细胞和人源细胞的基因组DNA的干扰，能够有效检测生物制品中残留Vero细胞基因组DNA，检测灵敏度高达0.03fg/μL。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用于检测Vero细胞基因组DNA的组合物、试剂盒及方法，更具体地，设计一种组合物、试剂盒、检测Vero细胞基因组DNA的方法。

背景技术

Vero细胞是从非洲绿猴(Cercopithecus Aethiops)的肾脏上皮细胞中分离培养出来的细胞系，它是一种异倍体细胞，是经过猕猴肾细胞培养衍化后产生的，和Hela细胞系、CHO细胞系和犬肾细胞系(MDCK细胞)一样，是在生物制品生产中经常用到的细胞系。Vero细胞系经常被用到如下领域：病毒疫苗的制备、培养病毒的细胞宿主、培养真核寄生虫的细胞宿主、大肠杆菌毒素的检测等。

重组生物制品绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中，残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。

在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。

Vero细胞属于传代细胞系，易于培养，适合大规模工业生产，是世界卫生组织推荐的人用疫苗细胞基质之一。因此，以Vero细胞为基质生产的疫苗的主要风险在于疫苗中残留的宿主基因组DNA具有潜在的肿瘤致病性。所以，建立准确的生物制品中Vero细胞残留基因组DNA的定量方法对于疫苗的安全性和质量控制至关重要。

现阶段，世界卫生组织推荐的标准是每剂量制品中的终DNA含量必须小于10ng；美国FDA建议使用检测灵敏度达到10pg的检测方法检测制品中的DNA水平；中国药典规定每剂量疫苗中的Vero细胞基因组DNA的残留量必须小于100pg。而随着科技的发展和人们对健康要求越来越高这个大趋势来看，上述对Vero细胞基因组DNA残留的安全量标准也会变得越来越高。因此，这就需要高效的，高灵敏度的引物、探针以及检测试剂来检测生物制品中残留的Vero基因组DNA。

迄今为止，常用的技术一般是针对Vero细胞基因组中的一类长的串联重复序列设计引物和探针，所设计的引物和探针能够具备一定的检测灵敏度，但仍然不高，最高的仅能达到1fg/μL。另外，由于Vero基因组与人源细胞基因组的同源性很高，现有技术中设计的引物并不能很好的排除来自于人源细胞基因组的干扰，并且现有技术中设计引物的灵敏度也并不能满足人们对检测灵敏度要求越来越高的标准。

综上所述，本领域急需能够检测生物制品中残留的Vero细胞基因组DNA的新引物、探针和检测方法。所述引物、探针和检测方法应具备高特异性，高灵敏度，操作简便，定量准确等优点，从而为生物制品，特别是疫苗的质量控制提供有利的支持。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题的发现和认识作出的：