[发明专利]一种鉴定甜菜筒喙象特异引物对及其应用

说明书

本发明提供了一种用特异性PCR引物检测甜菜筒喙象的分子鉴定方法。该方法利用RAPD技术获得甜菜筒喙象特异序列，并设计高效PCR扩增引物，建立与之相辅PCR检测体系，快速获得甜菜筒喙象特有223bp单一的DNA条带。该方法具有操作方便、鉴定准确等优点，可实现对甜菜筒喙象的快速分子鉴定，加快对该害虫检测以及针对性防治的反应速度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种甜菜筒喙象特异引物及其快速鉴定方法。

背景技术

甜菜筒喙象Lixus subtilis Boheman，属于鞘翅目象甲科，又名甜菜茎象甲，在我国主要危害甜菜，亦可危害藜科、蓼科、苋科的一些野生杂草。藜麦Chenopodium quinoaWilld，藜科藜属，原产于南美洲的安第斯山区。由于其富含矿物质、维生素、脂肪酸等，可降低罹患各种疾病的风险，被列为全球10大健康营养食品之一，具有极高的经济价值。近年来，藜麦在我国广泛引进种植，成为地方县市的支柱产品。随着藜麦种植的广泛开展，甜菜筒喙象逐渐成为藜麦的主要虫害。甜菜筒喙象为蛀茎害虫，成虫可在藜麦茎秆底部打孔并将卵产于植物组织中，孵化幼虫蛀空茎秆，严重影响营养输送，同时致使主茎易风折，植株成片倒伏，造成藜麦严重减产。甜菜筒喙象为害极为隐蔽，一旦发生极难挽回经济损失。因此对其防治主要以预防为主，需在播种前对地块害虫进行鉴定及针对性的布防。目前对甜菜筒喙象的种类鉴定，主要依靠成虫的外部形态学特征进行。这需要具备相关昆虫分类知识的专业人员以及专业的显微设备才能鉴别。加之而田间环境复杂，多种形态的甜菜筒喙象共存，如卵、幼虫、蛹及成虫等，加大了形态学鉴定的难度。需要甜菜筒喙象的快速准确鉴定方法的建立。

随着分子生物学的快速发展，分子方法在鉴定昆虫中有较多的应用。该类方法不受环境、害虫样本及人为因素的影响，具有较高的特异性和准确性。目前应用较为广泛的技术为DNA条形码(DNA Barcoding)，即利用线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因(cox1)5’端658bp的序列作为分类的依据。该技术需要一定的昆虫线粒体基因组信息作为支撑，并且需要对样品DNA进行测序比对，对于大规模的鉴定经济负担重且周期长。此外鉴定的结果准确性还受到假基因、母系遗传等干扰，需要辅以其他分子鉴定方法。RAPD(random amplifiedpolymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA技术，该方法通过人工合成的随机引物对物种的基因组DNA的进行PCR(Polymerase Chain Reaction)，以得到不同的带谱，对于某一特定物种中出现的特异条带就可作为该模板的分子标记。RAPD具有无需知道被研究生物基因组的信息的优势，现已应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究中。但该技术也存在PCR产物不特异、结果不稳定、重复性差等缺点，给分子学鉴定带来一定的困难。目前还需要对改方法进行进一步改进，以实现甜菜筒喙象快速和准确的分子鉴定。

发明内容

基于上述背景，本发明的目的为：提供一种甜菜筒喙象特异引物对及快速鉴定方法，通过该特异性引物对可以实现甜菜筒喙象的快速分子鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了检测甜菜筒喙象的特异性引物对，其由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成。该特异性引物对是在RAPD技术获得甜菜筒喙象序列基础上设计而来的。

本发明还提供了该特异性引物对在鉴定甜菜筒喙象的应用，包括以下步骤：

(1)待测样品基因组DNA的提取；

(2)以所述待测样品的基因组DNA为模板，采用本发明提供的特异性引物对其进行PCR扩增；

(3)对上述扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测，依据电泳检测结果判定样品中DNA模板是否来源于甜菜筒喙象；若电泳结果显示在223bp处有单一DNA条带，则该样品为甜菜筒喙象；若未扩增出223bp的序列片段，则样品为其它昆虫物种。