[发明专利]一种改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法

权利要求书

1.一种改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法，其特征在于,包括如下步骤：

取菲牛蛭冻干粉0.25g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液15m l，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，过滤，精密量取续滤液100μl 3次，分别置于3个试管中并分别将试管标记为A、B、C，分别加入含0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200μl，摇匀，3份待测试管置于水浴中37±0.5℃温浸5分钟，滴加每1ml中含有40单位的凝血酶溶液；

A试管样品首次滴加30μl，在计时的前20秒之内完成；

B试管样品首次滴加20μl，在1分钟的21-40秒完成；

C试管样品首次滴加10μl，在1分钟的后20秒完成，边滴加边轻轻摇匀；

上述操作表明若A试管样品、B试管样品、C试管样品都不凝固，则分别对应720U、480U、240U三个梯度的活性结果；

情形1：若样品A试管样品、B试管样品、C试管样品皆凝固，则说明抗凝活性低于240U；

此时需较为精确判定试管样品是否符合200U的合格标准，需再次取一次续滤液，即D试管样品，加入纤维蛋白原缓冲液水浴后，首次滴加凝血酶溶液5μl，边滴加边轻轻摇匀，D试管样品的制备和A试管样品、B试管样品、C试管样品相同，只是标号不同；

若D试管样品凝固，则判定样品抗凝活性不合格；

若D试管样品不凝固，则从第2分钟起每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，若滴加1μl达到4次，说明样品活性达到120+96＝216U，此时判定样品合格；

若滴加次数为3次或以下，说明活性为120+72＝192U以下，此时判定样品不合格；

情形2：若A试管样品、B试管样品凝固，C试管样品不凝固，说明抗凝活性高于240U、低于480U，此时直接判定为抗凝活性合格，但对于出厂前的质量记录需要检测的更为精准，遂继续采取以下操作：

在不凝固的C试管样品中继续滴加5μl，检测其活性是否达到360U；

若C试管样品凝固，说明样品活性在240U-360U之间，此时再取续滤液D试管样品，加入纤维蛋白原缓冲液水浴后，首次滴加凝血酶溶液10μl，从第2分钟起每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算D试管样品的活性结果；

若C试管样品不凝固，直接从第3分钟起每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算C试管样品的活性结果；

情形3：若A试管样品凝固，B试管样品、C试管样品不凝固，说明抗凝活性高于480U、低于720U，此时直接判定为抗凝活性合格，但对于出厂前的质量记录需要检测的更为精准，遂继续采取以下操作：

B试管样品在第2分钟滴加凝血酶溶液5μl，C试管样品在第2分钟滴加凝血酶溶液10μl；

若B试管样品不凝固，说明其活性大于600U，小于720U，则直接在第3分钟开始每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算B试管样品的活性结果；

若B试管样品凝固，说明样品活性大于480U，小于600U，此时C试管样品的活性已达到480U，则对C试管样品直接在下一分钟开始每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算C试管样品的活性结果；

情形4：若样品A试管样品、B试管样品、C试管样品均不凝固，说明抗凝活性高于720U，此时直接判定为抗凝活性合格，但对于出厂前的质量记录需要检测的更为精准，遂继续采取以下操作：

第2分钟，A试管样品滴加10μl、B试管样品滴加25μl、C试管样品滴加20μl凝血酶溶液，此时A试管样品、B试管样品、C试管样品对应的活性结果分别为960U、840U、720U；

若A试管样品、B试管样品凝固，C试管样品不凝固，说明样品活性大于720U、小于840U，直接在第3分钟开始对C试管样品每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算C试管样品的活性结果；

若A试管样品凝固，B试管样品、C试管样品不凝固，说明样品活性大于840U、小于960U，直接在第3分钟开始对B试管样品每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算B试管样品的活性结果；

若A试管样品、B试管样品、C试管样品均不凝固，说明样品活性大于960U，此数值基本超出了绝大部分菲牛蛭冻干粉的活性范围，如确实发生，再次在第3分钟对A试管样品、B试管样品、C试管样品分别滴加10μl凝血酶溶液，使A试管样品、B试管样品、C试管样品对应的活性结果分别为1200U、1080U、960U；

若A试管样品、B试管样品凝固，C试管样品不凝固，说明样品活性大于960U、小于1080U，直接在第4分钟开始对C试管样品每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算C试管样品的活性结果；

若A试管样品凝固，B试管样品、C试管样品不凝固，说明样品活性大于1080U、小于1200U，直接在第4分钟开始对B试管样品每分钟滴加凝血酶溶液1μl至凝固，计算B试管样品的活性结果；

若A试管样品、B试管样品、C试管样品均不凝固，说明样品活性大于1200U，如确实发生，再次在第4分钟对A试管样品、B试管样品、C试管样品分别滴加10μl凝血酶溶液，重复上一步操作。

2.根据权利要求1所述的改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法，其特征在于，步骤1.菲牛蛭药材过三号筛；0.5％纤维蛋白原以凝固物计，三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液临用配制。