[发明专利]一种改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法

说明书

本发明提供一种改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法，包括取菲牛蛭冻干粉0.25g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液15ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，过滤，精密量取续滤液100μl3次，分别置于3个试管中并分别将试管标记为A、B、C，分别加入含0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200μl，摇匀，3份待测试管置于水浴中37±0.5℃温浸5分钟，滴加每1ml中含有40单位的凝血酶溶液。本发明在没有更改原操作方法的基本原理，最大程度保留云南标准的前提下，通过对最后滴定的步骤进行改进，并通过多次实验的验证，节省时间，准确度高，重现性高，降低结果的相对偏差，实验员能胜任原方法的检测，则本方法掌握难度很小。

技术领域

本发明属于中药材检测技术领域，尤其涉及一种改进的菲牛蛭冻干粉活性检测方法。

背景技术

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)，别名马尼拟医蛭，俗名金边蚂蟥，为医蛭科牛蛭属动物，具有破血通经，逐瘀消癥的功效，可用于血瘀经闭，癥瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤，及治疗脑血栓，脑溢血，高粘血症，高血压病，肺心病等，为常用特色民族中药材。

目前，菲牛蛭作为中药饮片，已经被《云南省中药饮片标准》(云YPBZ-0199-2013)纳入管理，现在从事菲牛蛭冻干粉生产的企业也不在少数，而评价菲牛蛭冻干粉是否符合出厂标准的重要指标之一就是《云南省中药饮片标准》中，关于抗凝血酶活性，以下简称“抗凝活性”的指标检测。

目前，云南省标准对于抗凝活性含量测定方法参照1970年Markwarde报道的凝血酶滴定法制定，其原理为水蛭有效活性物质与凝血酶的结合比例为1:1，一个活性单位等于中和一个单位凝血酶的水蛭有效活性物质的量。

此滴定法相较于生色底物比色法、光散射法、纤维蛋白原平板法、APTT试剂盒法、PT试剂盒法等方法，有设备要求简单、试剂耗费量小等优势，遂为2020年版中国药典对于水蛭药材抗凝活性评价、云南省中药饮片标准菲牛蛭冻干粉抗凝活性评价指定方法，其测量方法和相应结果具有法律效力，对于菲牛蛭冻干粉这一产品规格，仍是各大药品生产企业、三方检测试验室对其抗凝活性指标评价的主流方法。

而此滴定法在操作过程中容易受到诸多外部因素影响，而且对于实验终点的判定主观，因此实验结果准确性较难保证，且检测结果重复性较差，因此通过减少外部因素对于检测过程的结果波动影响，对于简化检测操作、提高抗凝活性检测结果准确度有比较重要的现实意义。

由于在此滴定方法的原理下，对于不同品种的水蛭、以及相同品种不同规格的取样量、凝血酶溶液浓度、滴定间隔时间等因素都有差别，本发明只针对菲牛蛭冻干粉这个品种规格的《云南省中药饮片标准》(云YPBZ-0199-2013)检测方法进行改进。

现有技术一的技术方案

现在普遍依据《云南省中药饮片标准》(云YPBZ-0199-2013)的检测方法进行检测，具体步骤如下：

取菲牛蛭冻干粉约0.25g，精密称定，精密加入0.9％氯化钠溶液15ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，过滤，精密量取续滤液100μl，置试管中，加入含0.5％纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液[注1](临用配置)200μl，摇匀，置水浴中(37℃±0.5℃)温浸5分钟，滴加每1ml中含有40单位的凝血酶溶液[注2](每1分钟滴加1次，每次5μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按以下公式计算：

U＝C1V1/C2V2，其中U为每1g含凝血酶活性单位，U/g；C1为凝血酶溶液的浓度，μ/ml；C2为供试品溶液的浓度，g/ml；V1为消耗凝血酶溶液的体积，μl；V2为供试品溶液的加入量，μl。

中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。

冻干粉每1g含抗凝血酶活性应不低于200.0U。