[发明专利]抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用

权利要求书

1.抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1：构建shRNA-Ptpn2质粒

利用引物设计制备shRNA-Ptpn2基因，将shRNA-Ptpn2基因搭载于pGpU6/GFP/Neo质粒中构建靶向下调Ptpn2的shRNA-Ptpn2质粒，再通过大肠杆菌扩增shRNA-Ptpn2质粒；

S2：合成HA-DOX

将透明质酸HA氧化后形成的芳香醛与阿霉素DOX的氨基通过亚胺键形成席夫碱HA-DOX，简称HD；

S3：制备M1巨噬细胞膜

S4：制备纳米载药系统M1HD@RPR

将5μg步骤S1构建的shRNA-Ptpn2质粒与25μg细胞穿膜肽iRGD混合，静置5min，形成iRGD与shRNA-Ptpn2的共混物iRGD-shRNA-Ptpn2，简称RR；向共混物RR中加入125μg PEI，静置混合5min，得PEI与RR的复合物iRGD-PEI-shRNA-Ptpn2，简称RPR；再静置混合5min，加入含50μg DOX的HA-DOX，混匀自组装得HD@RPR纳米粒HA-DOX@iRGD-PEI-shRNA-Ptpn2；之后采用微型挤出器将步骤S3中制备的M1巨噬细胞膜与HD@RPR纳米粒反复过400nm聚碳酸酯膜后得M1HD@RPR纳米载药系统，4℃保存即可。

2.根据权利要求1所述的抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，步骤S1中的引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.1，反向引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，步骤S2中的HA-DOX的合成方法具体如下：

a.HA的氧化

将0.4g HA溶于10mL去离子水中制得HA溶液，然后将0.053gNaIO₄溶于5mL去离子水中，制备NaIO₄溶液，将NaIO₄溶液逐滴加入HA溶液中，避光搅拌12h，再加入乙二醇继续搅拌0.5h，将得到的溶液用去离子水透析除去NaIO₄，纯化48h后冷冻干燥得海绵状产物OHA；

b.合成HA-DOX

取步骤a中的OHA0.2 g，将0.2g OHA和40mg DOX·HCl共同加至30mL经超声脱气的ddH₂O中，在氮气保护下于50℃条件下避光反应48h，之后再用去离子水透析48h以除去未参加反应的DOX·HCl，冷冻干燥得红色海绵状产物HD。

4.根据权利要求1所述的抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，步骤S3中的M1巨噬细胞膜的制备方法如下：取对数生长期的RAW264.7细胞，待细胞密度达到70％时，加入100ng/mL脂多糖LPS及10ng/mL IFN-γ，作用24h后，收集M1型巨噬细胞；之后采用预冷的Tris-镁盐缓冲盐重悬细胞，使细胞浓度为2×10⁷个/mL，在微型挤出器仅用垫片情况下反复挤出20次以破坏细胞，然后采用蔗糖梯度离心法提取细胞膜，再采用100W功率超声2min，即得所需M1巨噬细胞膜。

5.根据权利要求1所述的抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，步骤S4中的M1巨噬细胞膜与shRNA-Ptpn2的配比如下：每5μgshRNA-Ptpn2加入0.034mg M1巨噬细胞膜。

6.根据权利要求1所述的抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，其特征在于，步骤S4中M1巨噬细胞膜与HD@RPR纳米粒过400nm聚碳酸酯膜的次数为20次。

7.权利要求1-6中任一项所述的制备方法制备的纳米载药系统。

8.权利要求7所述的纳米载药系统在制备治疗黑色素瘤或肺转移黑色素瘤的药物中的应用。