[发明专利]抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，公开了抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，包括构建shRNA‑Ptpn2质粒、合成HA‑DOX、制备M1巨噬细胞膜和制备纳米载药系统M1HD@RPR；还公开了纳米载药系统和应用。本发明实现药物在体内肿瘤部位的靶向递送，用于黑色素瘤原发及肺转移瘤抑制治疗，为目前对黑色素瘤无显著有效的治疗方案的困境提供了新的攻破方向；能高效率转染黑色素瘤细胞、具有良好的稳定性、能自我复制、发挥高效的黑色素瘤治疗率，本发明通过shRNA在细胞内切割转变成为siRNA，从而发挥RNAi的作用使基因沉默，利用shRNA是小干扰RNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体，使得其能在细胞内较为稳定的发挥RNAi作用。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用。

背景技术

恶性黑色素瘤是一种侵袭性极强、易发生治疗耐受的恶性肿瘤，在世界范围内，黑色素瘤的发病率稳步上升，导致公共卫生问题日益严重，目前正成为皮肤首位致死性疾病。

目前，化疗成为治疗已有转移的黑色素瘤晚期患者的主要治疗方式，比如单药化疗或者联合化疗。然而化疗往往存在副作用大、远期效果无法令人满意以及容易产生耐药性的缺点。随着肿瘤免疫学的发展，研究发现黑色素瘤免疫原性较高，免疫治疗在恶性黑色素瘤生物治疗中获得广泛应用并成为其个性化治疗的研究热点，但是由于肿瘤的发生发展是一个多基因变异、多因素共同作用的结果，单一方法治疗难以达到理想效果，因而免疫治疗与其他治疗手段联合成为黑色素瘤治疗的发展趋势。比如将化疗与免疫治疗进行联合，一方面免疫治疗可通过在抗原释放前激活和增强免疫反应扩增识别抗原来激活T细胞以增强化疗效果；另外一方面化疗可通过诱导提高肿瘤细胞的免疫原性，化疗与免疫治疗联合存在相辅相成的联系。

受到上述启发，发明人拟将阿霉素(Doxorubicin，DOX)与免疫疗法联合治疗小鼠黑色素瘤。2017年《Nature》报道，Ptpn2的缺失能够：①增强肿瘤细胞对免疫治疗的敏感作用；②增强肿瘤细胞内细胞毒性T细胞CD8⁺的活性；③增强IFN-γ释放及肿瘤对IFN-γ的敏感性；④促进肿瘤微环境中M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化。因而，靶向下调Ptpn2基因能发挥肿瘤免疫治疗效果。由于阿霉素较强的毒副作用尤其是心脏毒性，导致其在临床应用中给患者造成了极大的身体负担。纳米载药系统因具有特有的表面效应，比如比表面积较大且根据制备工艺及原料不同可进行多功能修饰，因而可作为治疗药物输送载体，实现药物的靶向及可控释放，并且可实现同时包载多种治疗药物及生物大分子，从而达到多种治疗手段协作的目的。随着纳米载药系统在免疫治疗领域的发展，受启发于脂质体中磷脂双分子层可用于药物递送，许多功能性细胞膜被用于纳米粒的设计以达到生物治疗的目的，比如红细胞膜、肿瘤细胞膜、中性粒细胞膜、巨噬细胞膜等，其细胞膜表面天然携带的许多生物标记分子可使载药系统在体内达到长循环或者靶向递送，甚至发挥免疫治疗的目的。研究发现M1型巨噬细胞膜可通过与肿瘤细胞间形成纳米管隧道及上调本身趋化因子受体2(Chemoattractant Cell Receptor 2，CCR2)以及CCR4从而对肿瘤细胞等有优异的靶向作用。

发明内容

基于以上问题，本发明提供抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法及应用，本发明的纳米载药系统能高效率转染黑色素瘤细胞、具有良好的稳定性、能自我复制、能发挥高效的黑色素瘤治疗率，为目前对黑色素瘤无显著有效的治疗方案的困境提供了新的攻破方向。

为解决以上技术问题，本发明提供了抑制黑色素瘤生长的纳米载药系统的制备方法，具体步骤如下：

S1：构建shRNA-Ptpn2质粒

利用引物设计制备shRNA-Ptpn2基因，将shRNA-Ptpn2基因搭载于pGpU6/GFP/Neo质粒中构建靶向下调Ptpn2的shRNA-Ptpn2质粒，再通过大肠杆菌扩增shRNA-Ptpn2质粒；

S2：合成HA-DOX