[发明专利]一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法

权利要求书

1.一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组载体，包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

3.一种重组菌，包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；所述重组菌为大肠杆菌重组菌。

4.一种大肠杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：

（1）PCR扩增权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，PCR引物为Opt-Lys-F，如SEQ ID NO.2所示与Opt-Lys-R，如SEQ ID NO.3所示；

扩增产物纯化后，获得包含pET22b载体同源臂以及基因Opt-Lys的扩增片段；将该片段连接到经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段，构建重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys；

（2）将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys。

5.如权利要求4所述构建方法，其特征在于， 步骤（1）中使用同源重组法将扩增片段连接至pET22b(+)载体片段，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取转化子于含有氨苄青霉素的LB培养基，于36-37℃、180-200 rpm培养12-16h，然后提取质粒，使用引物Opt-Lys-F与Opt-Lys-R进行质粒PCR验证后，得到重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys。

6.如权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增条件：2×Taq MasterMix 25 μL，10μM的上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，add ddH2O至50μL；

PCR反应条件：95 ℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，50℃ 退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min，4℃保存。

7.如权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤（2）中将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys通过热激法至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布至含有氨苄青霉素抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取菌落获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys。

8.权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌在产溶葡萄球菌酶中的应用。

9.权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌接种含有氨苄青霉素以及终浓度为48-51 mM甘氨酸的LB培养基中，培养到OD_600nm至0.25-0.35后，添加终浓度为0.8-1.1g/L的乳糖，并在36-37 ℃、 180-200 rpm培养35-37 h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。