[发明专利]一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法

说明书

本发明提供了一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法，主要提供了一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法，包括如下步骤将大肠杆菌重组菌接至含有氨苄青霉素以及终浓度为48‑51mM甘氨酸的LB培养基中，培养到ODsubgt;600nm/subgt;至0.25‑0.35后，添加终浓度为0.8‑1.1g/L的乳糖，并在36‑37℃、180‑200rpm培养35‑37h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。在本发明中，仅通过对溶葡萄球菌酶编码基因的密码子优化，即可实现了其在大肠杆菌中的分泌表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。它是一种人兽共患病原菌，可导致人和动物的多种疾病，包括伪膜性肠炎、败血症和脓毒症等，严重威胁人类和动物的生命安全。抗生素最早用来治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，但是容易导致耐药性的出现。金黄色葡萄球菌细胞壁中含有大量Gly五肽交联桥，而溶葡萄球菌酶(lysostaphin,Lys)可以专一性地作用于此结构，从而裂解细胞壁，对金黄色葡萄球菌具有很好的溶菌杀菌效果。成熟溶葡萄球菌酶是一种分子质量约为27.0kDa的Zn²⁺依赖蛋白酶。此外，溶葡萄球菌酶的溶菌活性不受金黄色葡萄球菌生长周期的影响，而且不会产生耐药性。所以溶葡萄球菌酶在预防和治疗葡萄球菌感染，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与耐多药金黄色葡萄球菌(MDRSA)感染的一种很有前景的治疗剂，在生物技术应用方面也具有巨大潜力。

尽管溶葡萄球菌酶有非常大的应用潜力，但由于其生产的高成本，目前仍没有广泛应用于医学或兽医实践或食品工业。过去的研究中，已有几种溶葡萄球菌酶异源过表达系统，包括毕赤酵母、大肠杆菌和乳酸乳球菌。虽然这些研究人员试图提高溶葡萄球菌素的产量，但结果仍不令人满意。在毕赤酵母表达系统中，蛋白表达过程中会发生糖基化，导致酶活性降低。而且毕赤酵母存在发酵周期长、培养成本昂贵、诱导剂甲醇存在危险性等缺点。大肠杆菌具有遗传背景清楚、遗传操作简单、生长繁殖快、目标基因表达水平高，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，其表达外源基因产物的水平也远高于其它原核基因表达系统，所以大肠杆菌成为目前应用最广泛的蛋白质表达宿主。研究人员也利用大肠杆菌作为宿主，进行了不同的尝试。但结果表明溶葡萄球菌酶均为胞内表达，且产量也不高。乳酸乳球菌中Nisin控制的基因表达系统NICE表达溶葡萄球菌酶时，虽然该系统的下游纯化过程简单，但是最终产量仅约100mg/L，未能实现高效生产。

中国专利文献CN1900290A(申请号：200510028038.0)公开了一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法。该专利文献中是将适合在大肠杆菌中分泌表达的编码信号肽的序列克隆于部分或全部成熟溶葡萄球菌酶的基因序列前，实现溶葡萄球菌酶在大肠杆菌中的外分泌表达。

中国专利文献CN111748544A(申请号：202010665840.5)公开了一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法，该专利文献采用毕赤酵母表达系统进行溶葡萄球菌酶的分泌表达，根据毕赤酵母密码子偏好性对溶葡萄球菌酶的成熟进行密码子优化，在基因序列末端添加终止密码子TAA，并在优化序列前需要添加适宜毕赤酵母的分泌序列。

中国文献《溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究》，表述了根据溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段，构建溶葡萄球菌酶基因表达载体，并在优化序列前需要添加适宜乳酸克鲁维酵母的分泌序列。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法。