[发明专利]一种多重基因调控下游基因检测方法在审
| 申请号： | 202210282034.9 | 申请日： | 2022-03-21 |
| 公开（公告）号： | CN114606255A | 公开（公告）日： | 2022-06-10 |
| 发明（设计）人： | 后加乐;王雪玲 | 申请（专利权）人： | 后加乐 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/865 |
| 代理公司： | 西安赛嘉知识产权代理事务所(普通合伙) 61275 | 代理人： | 李迎英 |
| 地址： | 431500 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 多重 基因 调控 下游 检测 方法 | ||
1.一种多重基因调控下游基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pBridge载体扩增Met25启动子表达框，并通过T4连接酶连接至经NotI和NheI线性化后的pGADT7载体，重组载体命名为pGADT7-Met；
(2)将TF以同源重组的方式构建到pGADT7-Met，并与AD融合；
(3)将另一个基因以同源重组的方式克隆至步骤(2)载体中的Met25启动子启动的表达框，构建好的基因和载体命名为pGADT7-TFMet-基因；
(4)全基因合成GAL4基因，用SacI和PteI线性化pHis载体，以同源重组方式构建至pHis2载体上，将报告基因组氨酸缺陷变为GAL4，载体命名为pGAL4；
(5)将下游基因启动子pro构建到步骤(4)所构建的pGAL4载体多克隆位点处，构建好的载体命名为pGAL4-pro；
(6)pGAL4-pro转化酵母宿主，涂布SD/-Trp平板，并检测启动子在酵母中内源基因的转录抑制浓度；
(7)将pGADT7-TFMet-基因载体转化步骤(6)酵母菌株，涂布SD-Trp/-Leu平板，并进行阳性克隆的筛选；
(8)将步骤(7)生长出来菌斑加入NaCl溶液中，并稀释OD600值至0.01涂布到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板和SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板，观察酵母生长状态，若TF和pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上正常生长且变蓝，若TF通过基因相互作用修饰后与pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上不生长，在SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上生长且变蓝。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的双框表达载体第二表达框为Met25启动子表达框。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述TF通过基因相互作用修饰后与pro相互作用的报告基因为GAL4。
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