[发明专利]一种多重基因调控下游基因检测方法

说明书

本发明公开了一种多重基因调控下游基因检测方法，在多重基因调控下游基因检测实验中，本发明以酿酒酵母为宿主，使用载体为双表达框，其中第二表达框以pMET25为启动子，通过甲硫氨酸缺陷与否来调控第二表达框基因表达与否，再通过第二表达框基因表达与否来检测第一表达框表达基因(TF)和第二表达框表达基因(基因)的相互作用来检测对下游基因Pro的调控。本发明技术方案成本低、工作量小、可行性高，可广泛应用于多重基因调控下游基因检测。

技术领域

本发明属分子生物学技术领域，具体涉及一种多重基因调控下游基因检测方法。

背景技术

酵母单杂交是研究蛋白质相互作用的重要方法之一。原理是：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录，但目前还未见多重基因调控下游基因检测方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种多重基因调控下游基因检测方法，该方法操作简单成本较低、工作量小。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施，包括如下步骤：

(1)以pBridge载体扩增Met25启动子表达框，并通过T4连接酶连接至经NotI和NheI线性化后的pGADT7载体，重组载体命名为pGADT7-Met；

(2)将TF(转录因子)以同源重组的方式构建到pGADT7-Met，并与AD融合；

(3)将另一个未知基因以同源重组的方式克隆至步骤(2)载体中的Met25启动子启动的表达框，构建好的基因和载体命名为：pGADT7-TFMet-基因；

(4)全基因合成GAL4基因，用SacI和PteI线性化pHis载体，以同源重组方式构建至pHis2载体上，将报告基因组氨酸缺陷变为GAL4，载体命名为pGAL4；

(5)将下游基因启动子pro构建到所构建的pGAL4载体多克隆位点处，构建好的载体命名为pGAL4-pro；

(6)pGAL4-pro转化AH109或Y2Hgold宿主，涂布SD/-Trp平板，并检测启动子在酵母中内源基因的转录抑制浓度；

(7)将pGADT7-TFMet-基因载体转化AH109(pGAL4-pro)或Y2Hgold(pGAL4-pro)酵母菌株，涂布SD-Trp/-Leu平板，并进行阳性克隆的筛选；

(8)将生长出来菌斑加入NaCl溶液中，并稀释OD600值至0.01涂布到SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板和SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板，观察酵母生长状态，若TF和pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上正常生长且变蓝，若TF通过基因相互作用修饰后与pro相互作用，那么在SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上不生长，在SD-Met/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal/3-AT平板上生长且变蓝。

采用本发明的产生的有益效果为：

本方法具有成本低、工作量较小、可行性高等优点，可广泛应用于多重基因调控下游基因检测。