[发明专利]共价有机网络材料原位包埋固定化酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种共价有机网络材料(CONs)原位包埋固定化酶的制备方法，基于一锅法共沉淀策略，以酶诱导醛基与氨基间的席夫碱反应对酶进行原位固定化制备了酶@CONs，在酶表面形成CONs多孔性保护涂层，实现了原位制备CONs固定化酶颗粒及高效负载酶分子。基于强共价键的CONs，赋予酶分子在非生物条件下仍具有优异的稳定性和活性回收率，有效降低生物催化剂的使用成本和操作条件；此外，相较于常用的酶@MOFs，CONs的多级孔结构有效降低了固定化酶介质导致的传质阻力，加速了底物/产物的快速扩散，从而表现出更高的反应活性和底物转化效率。本发明制备方法简单易行，适用于构建一系列酶@CONs固定化酶颗粒。

技术领域

本发明属于固定化酶技术领域，尤其涉及一种CONs原位包埋固定化酶的制备方法。

背景技术

当前经济社会发展面临诸多挑战，如人口急剧增加、土地和水资源日益枯竭、全球变暖逐渐加剧等重大环境问题。因此，构建更加绿色可持续的生产制造模式成为未来发展的必然趋势。生物酶催化是一类以酶为催化剂进行物质合成与转化的绿色催化过程，因具有反应条件温和、催化活性高、产物选择性高等优势，被广泛应用于合成大宗化学品、医药化学品、精细化学品等，是实现绿色生物制造和“双碳”目标的高效催化剂。

绿色生物制造核心是高效的生物催化元件，酶是最常用的生物催化元件之一。然而，一般工业生产中，酶催化反应一般在液相环境进行，反应后面临酶催化剂流失严重、产品纯化工艺复杂等难题，造成产品成本升高。此外，游离酶在细胞外的催化过程易受高温、酸碱等因素影响，进一步限制了酶的规模化应用。模拟自然界细胞结构，利用多孔材料介质原位包埋酶分子，可有效提升酶分子的稳定性和回用性。但仍面临合成步骤较繁琐、介质结构不规则、介质稳定性较差等缺点。

发明内容

针对现有技术，本发明以葡萄糖氧化酶(GOx)为模型酶，提出了基于“一锅法”共沉淀制备酶@CONs固定化酶颗粒的方法，构建了GOx@CONs固定化酶颗粒实现了酶分子在类规整材料内的原位包埋，实现了酶促转化过程的高效强化。CONs有效地屏蔽了高温，有机溶剂等非生物条件对酶的影响，提高了酶催化剂的半衰期，显著降低了酶催化剂的使用成本。CONs的多级孔结构提供了底物或产物的快速运输通道，有力削弱了传质对固定化酶催化反应过程的影响。此外，固定化酶颗粒具有一定的机械强度和形状，可进行再设计和二次加工，实现酶催化剂与底物或产物的高效快速分离和工业酶制剂的连续规模化生产等。本发明涉及的CONs是一种集稳定性与多孔性的优良固定化酶介质，可用于原位包埋生物催化剂(酶)进而构建高效的固定化酶颗粒，实现绿色低碳和连续高效的化学转化，打破固定化酶介质的高效传质-结构稳定性的trade-off效应。

为了解决上述技术问题，本发明提出一种共价有机网络材料(Covalent OrganicNetworks,CONs)原位包埋固定化酶的制备方法，首先，室温下，在磁力搅拌下分别将三醛基间苯三酚与联苯胺均以2:3的摩尔比分散于等体积的乙醇溶液中，充分搅拌，分别获得三醛基间苯三酚/乙醇分散液和联苯胺/乙醇分散液；将三醛基间苯三酚/乙醇分散液和联苯胺/乙醇分散液混合，然后以1:10的体积比向该混合溶液中加入2.5-7.5mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮修饰的葡萄糖氧化酶溶液，继续搅拌30min，将得到的悬浊液离心，以PBS缓冲液洗涤3次，冻干12个小时所得颗粒即为共价有机网络材料原位包埋固定化酶，简称为GOx@TpBD。

进一步讲，本发明所述的制备方法，其中：

磁力搅拌的转速为400-1000rpm；充分搅拌的时间为15-35min。

所述的浓度为2.5-7.5mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮修饰的葡萄糖氧化酶溶液的制备方法是：以浓度为100mM，pH＝7.0的PBS缓冲液为溶剂制备一定浓度的葡萄糖氧化酶溶液，将该葡萄糖氧化酶溶液与一定体积的聚乙烯吡咯烷酮溶液等体积混合，摇床孵化反应15min，即为所得，简称为PVP/GOx溶液。

将三醛基间苯三酚/乙醇分散液和联苯胺/乙醇分散液混合是以800rpm的转速搅拌30min。