[发明专利]一种几丁质酶Chi6115及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种几丁质酶Chi6115及其编码基因与应用。所述的酶序列见SEQ ID NO：2。本发明基于深海热液硫化物样品宏基因组测序数据，通过人工合成的方法获得几丁质酶chi6115基因序列，并添加酶切位点BamHI和XhoI，将该基因克隆入pET‑28a(+)表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，纯化得到较高纯度的重组几丁质酶Chi6115蛋白。该酶的最适温度为55℃，最适pH为6.0；在45～60℃和pH5.0～6.5范围内酶活力较高，其酶活力均保持85％以上；该酶不仅可以水解胶体几丁质，还可以水解不溶性几丁质底物，在几丁质资源开发利用和几丁寡糖制备方面具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种来源于深海热液硫化物的几丁质酶Chi6115及其编码基因与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

几丁质是海洋环境中最丰富的可再生的天然有机高分子聚合物，在自然界中其储量位居第二位，仅次于纤维素，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫外骨骼、真菌和藻类植物的细胞壁，全球每年由生物体产生的几丁质产量可达100～1000亿吨。几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖胺分子通过β-(1-4)糖苷键共价连接而成的多聚物，其可通过微生物几丁质酶水解β-(1-4)糖苷键进行分解，最后生成低聚糖、几丁二糖或N-乙酰葡萄糖胺。

几丁质具有抗菌、抗病毒、促进伤口愈合、降低胆固醇、止血及抗氧化等生物学特性，但高分子的几丁质黏度大且溶解性很差限制了其应用。通过化学法或酶法水解制备的几丁寡糖水溶性好且黏度降低具有良好的抗菌、抗氧化、降低高血压、免疫调节等功效。化学方法制备几丁寡糖经常需要极端反应条件从而产生无用的副产物，而微生物酶法生产几丁寡糖反应条件温和、对生态友好、特异性好且反应过程可控，因此成为替代化学法生产几丁寡糖的有效方法。

许多生物包括细菌、古菌、真菌、病毒、藻类、植物和动物都能够合成几丁质酶，几丁质酶通常分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。内切几丁质酶在几丁质分子内部随机水解几丁质，生成可溶性的低分子量的几丁寡糖，而外切几丁质酶从几丁质链的非还原末端释放几丁二糖。目前发现的几丁质酶大多数仅能水解用酸预处理后的几丁质，而能够直接水解未进行预处理的几丁质的水解酶报道很少。在几丁质水解前，需要对几丁质粉末(不溶性几丁质)用无机酸如盐酸、磷酸等进行预处理，使天然几丁质结构变得松散，易于水解。

深海热液区富含虾、蟹等多种甲壳类动物和丰富的微生物资源，几丁质的降解和再生对于维持深海热液区这个特殊海洋生态系统平衡起着非常重要的作用。从深海热液区挖掘新型高效几丁质酶可为几丁质资源的有效开发利用提供良好的基因和酶资源。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种几丁质酶Chi6115及其编码基因与应用。

编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)

本发明的另一目的，在于提供一种几丁质酶Chi6115的制备方法，它包括如下步骤：

(1)合成几丁质酶chi6115基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。

(2)重组质粒的构建