[发明专利]一种重组大肠杆菌及高纯度熊去氧胆酸的生产方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌能同时表达7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶是通过pETDuet1载体共表达的。

3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌通过以下方法构建得到：

(1)将7β-HSDH和GDH基因分别进行密码子优化，并进行全基因合成；

(2)先将合成的7β-HSDH基因连接入pETDuet1载体，得到pETDuet1-7β-HSDH重组质粒，再将GDH基因连接入pETDuet1-7β-HSDH质粒，得到共表达7β-HSDH和GDH的重组质粒pETDuet1-GDH-7β-HSDH；

(3)将pETDuet1-GDH-7β-HSDH转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到带有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH；

(4)将大肠杆菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH进行培养，即得到所述重组大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，步骤(1)中，编码7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列进行密码子优化后分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，步骤(4)中，所述大肠杆菌的培养包括以下步骤：

(1)将大肠杆菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH接种到LB固体平板培养基中活化培养，然后从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+)LB液体培养基的三角瓶中，震荡培养；

(2)将步骤(1)的培养物转接到含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+)的TB液体培养基，震荡培养一段时间，然后加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续培养；

(3)诱导表达结束后，离心收集细胞，即得到所述的重组大肠杆菌工程菌。

7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述LB固体平板培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15.0g/L；所述LB液体培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、；所述TB液体培养基包括以下组分：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L、磷酸氢二钾9.4g/L、磷酸二氢钾2.2g/L。

8.一种高纯度熊去氧胆酸的生产方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一所述的重组大肠杆菌进行生产。

9.根据权利要求8所述的高纯度熊去氧胆酸的生产方法，其特征在于，所述生产方法是进行全细胞转化生产。

10.根据权利要求9所述的高纯度熊去氧胆酸的生产方法，其特征在于，所述全细胞转化生产体系中，包括细胞湿重为1-100g/L,7-酮石胆酸浓度为1-200g/L,葡萄糖浓度为1-100g/L；体系的pH为7.0-9.0；于1℃～30℃条件下反应1～48小时。