[发明专利]一种重组大肠杆菌及高纯度熊去氧胆酸的生产方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种重组大肠杆菌及高纯度熊去氧胆酸的生产方法。本发明构建了一种新型的双酶共表达基因工程菌——重组大肠杆菌能，该菌同时表达7β‑羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，该菌可应用于高纯度熊去氧胆酸的生产。通过7β‑羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶联合表达及应用提高了目标产物的产量。本发明所述高纯度熊去氧胆酸的生产方法简单，生产过程产生的杂质少，且是符合环保要求的绿色工艺，具有重要的工业应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种重组大肠杆菌及高纯度熊去氧胆酸的生产方法。

背景技术

熊去氧胆酸，化学名称为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，英文名称为Ursodeoxycholic acid，UDCA。是传统的中药有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，在治疗胆结石、促进肝移植、胆汁反流性胃炎、酒精肝、胆汁性肝硬化和药物诱发的肝炎方面有非常好的疗效，市场用量很大。

目前，UDCA的制备方法主要有天然来源和人工合成两种方法。人工合成是指使用能够大量获得的牛、鹅胆汁提取的鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)化学法合成UDCA，通过氧化还原的方法使7-OH发生构型转变，但是存在着反应过程复杂、低选择性、反应条件苛刻、能耗大、污染大等一系列问题，尤其是保护和脱保护剂过程中需要有毒和危险试剂，严重限制了化学法的工业化应用。目前使用化学法生产的UDCA 约占市场份额的30％，而且纯度较低，约80％左右，远不能满足市场对UDCA的用量及质量要求。

与化学差向异构化相比，UDCA的生物合成具有高效性和相对环境友好性。微生物转化或生物酶催化主要围绕7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β- 羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)展开，利用产7α-HSDH和7β-HSDH的泥渣梭菌、不和谐梭菌、巴氏梭菌和嗜麦芽黄单胞菌，实现了CDCA向UDCA的生物转化。然而，高浓度的CDCA抑制细胞生物量的积累，在产品回收和纯化过程中存在困难。此外，以往的研究表明，随着培养时间的延长，中间体的产量增加，UDCA降低，无法实现工业化生产。近年来，联合应用7α-HSDH和7β-HSDH将CDCA 为底物两步法生成UDCA，成为研究热点，目前已经有研究的综合转化率能超过90％，但反应量仅为毫升级别，距离工业化生产还有很大距离。主要的限制性瓶颈为：

1)以CDCA为底物两步法中的关键酶7β-HSDH极度不稳定，尽管酶活够高，但在催化反应体系中会快速失活；

2)两步法的反应体系能够承载的底物量太低(体积比1％)，体系不稳定；

3)两步法的两种关键酶工业级应用的大规模来源问题；

4)酶蛋白分离纯化的成本过高。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高纯度熊去氧胆酸的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了熊去氧胆酸的高效生产。本发明提供了一种能低成本生产熊去氧胆酸的重组工程菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供能低成本生产熊去氧胆酸的重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌可以同时表达2种酶，分别为7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。所述重组大肠杆菌于2021年12月20日保藏于中国典型培养保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20211644；保藏地址为中国武汉武汉大学；菌株命名为Escherichia coli BL21(DE3)-pETDuetl-GDH-7β-HSDH。

优选的，所述7β-羟基类固醇脱氢酶，来自撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)，GenBank登录号为JN191345.1。