[发明专利]一种猫细小病毒样颗粒及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种猫细小病毒样颗粒及其制备方法与应用，选用自主分离的FPV JL‑125毒株的VP2序列进行重组杆状病毒FPV‑VP2株的制备，其中FPV JL‑125毒株和当前中国流行毒株有很高同源性，其VP2序列根据昆虫细胞密码子优化后，制备的重组杆状病毒FPV‑VP2株可正确表达FPVVP2蛋白。本发明采用全悬浮培养工艺培养，表达量大幅度提高同时，HA效价能达到2²⁰‑2²¹，是野生病毒培养效价的256‑512倍。表达的蛋白能自主装配成完整的FPV病毒样颗粒，与原病毒具有相似的空间结构，而病毒样颗粒有效价高、安全性更高，同时具有激发体液免疫和细胞免疫的优点。本发明使用基因工程手段制备病毒样颗粒抗原，进行新型猫细小病毒样颗粒疫苗的制备，具有更高的安全性和有效性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种猫细小病毒样颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

猫细小病毒病(Feline panleukopenia，FP)又称猫泛白细胞减少症、猫瘟、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(Feline panleukopenia Virus，FPV)引起的一种急性高度接触性传染病，临床表现以患病猫突发高热、呕吐、腹泻、脱水及循环血流中白细胞数量急剧减少为特征。FPV主要感染猫科与鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，1岁以内的幼猫发病率高达83.5％，而且全窝幼猫会陆续发病，是猫科动物最重要的传染病，对猫科动物生命造成了严重威胁。

为了猫免遭传染病的威胁，保持其身心健康，对其接种疫苗是关键。目前，市售疫苗均为进口疫苗，主要为猫三联疫苗，包括FPV、FCV、FHV。这些疫苗均为弱毒疫苗或灭活疫苗，而弱毒疫苗有潜在的安全隐患，灭活疫苗不能有效刺激机体产生细胞免疫等缺点。此外，病毒变异是导致当前疫苗免疫失败的主要原因。

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是含有一种或多种病毒结构蛋白的空心颗粒，形态上类似于天然病毒，没有病毒核酸，不能自主复制，与天然病毒相比较其不具有致病性但不影响其免疫原性，且具有较高的安全性。VLPs结构稳定，颗粒均一性好，具有广泛的应用前景。VLPs常用表达系统包括大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统、植物细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、无细胞表达系统等。本发明的猫细小病毒样颗粒疫苗采用的是昆虫细胞-杆状病毒表达系统，该系统所需要的周期远比动物或植物系统短，可以利用昆虫个体或其培养细胞进行大规模的表达生产，生产的重组蛋白产量高，蛋白翻译后加工比细菌、酵母生产系统完善，而且由于昆虫杆状病毒具有限制性的宿主范围，只对特定种属的昆虫及其细胞进行感染，对人畜等脊椎动物没有感染能力，因此具有比在哺乳动物及其培养细胞生产系统更为安全等优点而成为目前最有效的真核表达系统之一。

FPV VLPs的制备通常是利用病毒结构蛋白VP2表达后组装而获得的。目前常用的表达体系主要分为真核表达体系和原核表达体系，真核包含昆虫细胞表达系统和酵母表达系统，而原核主要是大肠杆菌表达系统。目前比较成熟的CPV VLPs利用真核表达系统的为多，主要原因是真核系统有利于实现外源蛋白翻译后的修饰和折叠，表达的重组VP2结构蛋白具有天然的分子构象，利于VLPs的形成。

目前，采用全悬浮培养工艺培养昆虫杆状病毒VP2的表达量有大幅度提高，然而HA效价不够高，同时，VLPs的纯度也是病毒样颗粒疫苗的重要质量指标之一，目前的VLPs的纯度一般在80％左右，纯度不高的VLPs在临床应用上还存在一些过敏反应，因此开发一种效价、纯度更高的猫细小病毒样颗粒对于生产更加安全、有效的猫泛白细胞减少症疫苗具有重大意义和价值。

发明内容

本发明的目的之一是，提供一种猫细小病毒样颗粒，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的猫细小病毒样颗粒，表达其氨基酸序列的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的猫细小病毒样颗粒，利用昆虫-杆状病毒表达系统表达。