[发明专利]一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用

权利要求书

1.一种萱草PDS基因VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系包含如SEQ ID NO.1所示的基因序列。

2.根据权利要求1所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系的构建方法按以下步骤进行：

一、提取萱草叶片RNA，反转录得萱草cDNA；

二、根据萱草转录组数据库获得PDSmRNA序列信息，并以该序列为模板设计引物，扩增PDS基因的CDS全长序列，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有PDS基因的CDS序列的重组质粒；

三、采用引入EcoRⅠ和BamHI酶切位点的特异性引物，以步骤二中的重组质粒为模板进行PCR扩增，纯化获得萱草PDS特异性核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示；

四、以EcoRⅠ和BamHI内切酶为酶切位点，将萱草PDS特异性核苷酸片段和TRV 2质粒进行双酶切，胶回收纯化后用T4连接酶过夜连接，再将连接产物转化大肠杆菌中扩繁，提取重组质粒，进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV 2命名为TRV2-PDS重组质粒。

3.如权利要求1所述的萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于所述应用的方法为：

一、将TRV2-PDS重组质粒和TRV1质粒分别转入农杆菌感受态细胞中，挑取转化后的阳性农杆菌菌落接种至LB抗性液体培养基中，28℃，200rpm培养14-16h；然后再将培养后的菌液分别以体积比1:20的比例接入含200μM乙酰丁香酮的液体抗性培养基，28℃，200rpm培养14-16h，培养至OD600＝1.0-1.3，收集含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液；

一、分别将含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液5000rpm离心15min，再用重悬液重悬菌液沉淀，将重悬后的TRV2-PDS菌液和TRV1菌液等体积混合，得到侵染液；

三、使用侵染液侵染萱草；其中侵染萱草的方法为浸种法、叶片注射法、真空渗透法或注射胚乳法；

四、继续培养萱草幼苗，浸种法侵染后培养的萱草幼苗待出现第二片叶时检测被沉默基因的表达量；叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染的萱草幼苗，待侵染2-3次后检测被沉默基因的表达量。

5.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于重悬液的配方为：300μM乙酰丁香酮、10mM MgCl₂、10mM乙磺酸和400mg/L半胱氨酸。

6.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于步骤二重悬至菌体OD₆₀₀＝1.2。

7.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于含有TRV2-PDS的农杆菌菌液和含有TRV1的农杆菌菌液等体积混合后室温黑暗静置活化3-5h。

8.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于步骤三中注射胚乳法是使用1mL带针头的无菌注射器，将活化后的侵染液注射到已发芽萱草幼苗的胚乳中。

9.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染每7d一次，重复浸染1-2次。

10.根据权利要求4所述的一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用，其特征在于使用侵染液侵染萱草幼苗后在黑暗处理24h后再置于22℃，16h光照和18℃，8h黑暗的条件下培养。