[发明专利]一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用

说明书

一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用，本发明涉及一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用，本发明的目的是为了提供一种沉默效率高的萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用方法。本发明一种萱草PDS基因VIGS沉默体系包含如SEQ IDNO.1所示的基因序列。萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。本发明通过浸种法、叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染萱草幼苗，皆出现不同程度的白斑与白化现象，后期通过qPCR检测PDS基因的表达量，相比于对照，采用以上方法侵染后的萱草PDS基因表达量皆有效降低。本发明适用于萱草基因工程领域。

技术领域

本发明涉及一种萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用。

背景技术

病毒介导的基因沉默技术VIGS(virus induced gene silencing)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默，出现相应的表型变化。VIGS技术在当代植物上直接产生RNAi效果，大幅度节约时间和成本；可同时实现多个基因的沉默；避免了传统转基因体系的弊端，尤其适合转化体系不成熟的植物和受基因型限制的品种，因而在植物基因功能的研究中应用越来越广泛。

萱草(Hemerocallis fulva)是原产我国的多年生宿根花卉，其不但具有很高的观赏价值和食用价值，同时兼具耐热、耐寒、耐旱、耐瘠薄、抗倒伏等抗性优势。目前，国内外学者对萱草的研究主要集中于育种方面，其分子生物学研究方面仍处于起步阶段。同时，萱草遗传转化体系虽已建立，由于萱草为多年生宿根植物，生长周期长，愈伤诱导耗时久，在一定程度上制约了萱草基因功能研究的进展，而VIGS技术不需要遗传转化体系就能获得基因沉默植物，从而有望克服上述瓶颈来大大促进相关基因的功能鉴定，因此，亟待建立一套VIGS技术在萱草中高效诱导内源基因沉默的体系。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种沉默效率高的萱草PDS基因VIGS沉默体系及其应用方法。

一种萱草PDS基因VIGS沉默体系包含如SEQ IDNO.1所示的基因序列。

所述一种萱草PDS基因VIGS沉默体系的构建方法按以下步骤进行：

一、提取萱草叶片RNA，反转录得萱草cDNA；

二、根据萱草转录组数据库获得PDS mRNA序列信息，并以该序列为模板设计引物，扩增PDS基因的CDS全长序列，连接至pMD19-T载体中并转入大肠杆菌后，进行蓝白斑筛选，挑单克隆阳检，获得连有PDS基因的CDS序列的重组质粒；

三、采用引入EcoRⅠ和BamHI酶切位点的特异性引物，以步骤二中的重组质粒为模板进行PCR扩增，纯化获得萱草PDS特异性核苷酸片段，如SEQ IDNO.1所示；

四、以EcoR Ⅰ和BamHI内切酶为酶切位点，将萱草PDS特异性核苷酸片段和TRV 2质粒进行双酶切，胶回收纯化后用T4连接酶过夜连接，再将连接产物转化大肠杆菌中扩繁，提取重组质粒，进行双酶切和测序验证，将成功连接PDS的TRV 2命名为TRV2-PDS重组质粒。

一种萱草PDS基因VIGS沉默体系在鉴定萱草PDS基因中的应用。

本发明通过浸种法、叶片注射法、真空渗透法和注射胚乳法侵染萱草幼苗，皆出现不同程度的白斑与白化现象，后期通过qPCR检测PDS基因的表达量，相比于对照，采用以上方法侵染后的萱草PDS基因表达量皆有效降低。

本发明的有益效应：

1、本发明首次通过成功构建萱草PDS基因VIGS沉默体系，获得了具有能够使萱草PDS基因沉默的体系。

2、本发明采用烟草脆裂病毒构建萱草PDS基因沉默体系，能够在萱草植株内进行系统扩散并表达。