[发明专利]一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器

权利要求书

1.一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器，其特征在于：所述的SERS传感器包括金盘温控电极HAuE，金电极AuE，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4-MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag，其中：

基底探针H1：

5'-CGACCGGATCAATAAGACTTCAACCTCAGCCTCACTCTTATTGATCGGTCGTTTTT-(CH₂)₆-SH-3'；

捕获探针H2：5'-GGTTGAAGTCTCAATAAGACTTCAACCTCATTTT-(CH₂)₆-SH-3'；

引发探针triDNA：5'-TCAATAAGAGTGAGGC-3'；

信号探针sDNA：5'-GACTTCAACCTTTT-(CH₂)₆-SH-3'。

2.如权利要求1所述的一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）金纳米立方块的制备

将0.6 mL 10 mM的NaBH₄溶液加入到含有10 mM HAuCl₄的10 mL 0.1 M的CTAB溶液中，轻摇2 分钟，随后打开反应瓶瓶塞于28℃水浴3 小时以确保溶液中的NaBH₄ 完全分解，得到金种子溶液；将2 mL 0.5 mM的HAuCl₄溶液添加到由2 mL 0.2 M的CTAC、1.5 mL 0.1 M的AA和50 μL金种子溶液组成的混合物中，于27℃保持15分钟，随后14000 rpm离心30分钟，除去上清液后，将沉淀分散在1 mL 0.02 M的CTAC溶液中，得到粒径10 nm的金纳米粒子溶液；将125 μL粒径10 nm的金纳米粒子溶液与25 mL 0.1 M的CTAC和1.825 mL 0.01 M的AA溶液在200 rpm磁力搅拌下于30℃混合2分钟，随后将搅拌速度调节至950 rpm，加入25 mL 0.01M的HAuCl₄溶液并于30℃反应15分钟，可以观察到混合溶液颜色由浅红色逐渐变为深红色，随后8000 rpm离心20分钟，除去上清液后，将沉淀重新分散在1 mL 0.01 M的CTAC溶液中，得到金纳米立方块溶液，储存在4℃备用；

（2）SERS tag的制备

将5 μL 10 μM的sDNA与5 μL 10 mM的TCEP在室温下避光混合1小时，在此期间，将25 μL金纳米立方块溶液离心后用水离心洗涤两次，离心条件为4500 rpm 10 min，去除上清液后，将所得沉淀与处理过的sDNA混合，然后加入190 μL 0.01 wt. %的SDS溶液，并于37℃300 rpm条件下孵育过夜，再加入2 μL 2 mM的4-MBA乙醇溶液并在37℃条件下继续孵育2h，得到 AuNCs/sDNA/4-MBA溶液；将AuNCs/sDNA/4-MBA溶液在4500rpm条件下离心三次，每次10 分钟，以去除未修饰的 sDNA 和 4-MBA，在前两次的离心中，将所得沉淀分散在0.01wt. %的SDS溶液中，最后一次离心后，将所得沉淀分散在含有0.01 wt.% SDS的10 mMpH7.4的PB溶液中，随后每半小时加入一次2 M的NaCl，直至NaCl的终浓度为0.1 M，得到SERS tag溶液，于4 ℃保存备用；

（3）酶辅助链置换扩增反应

温控金盘电极HAuE用0.05 μm氧化铝粉末进行抛光，然后依次在无水乙醇和超纯水中超声清洗，再在0.5 M H₂SO₄溶液中采用循环伏安法进行电化学清洗，最后用去离子水冲洗电极并在氮气下干燥；基底探针H1固定在HAuE之前，先在95℃加热5分钟，然后将其冷却至37℃；接下来，将5 μL 10 μM的捕获探针H1与含有0.2 M NaCl的5 μL 10 mM的TCEP室温避光混合1小时，将10 μL混合物滴在HAuE表面并在37℃条件下组装2小时，得到HAuE/H1；用含有0.1 M NaCl的10 mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗HAuE/H1后，再在2 mM的MCH中封闭1 h，得到HAuE/H1/MCH；在捕获探针H1固定过程中，制备反应溶液1，所述反应溶液1包含1 × DamMTase Reaction Buffer和1 × rCutSmart™ Buffer，总体积为290 μL，然后向反应溶液1中加入不同浓度的Dam MTase、20000 U▪mL^-1 1.3 μL的DpnI和, 5 μL 320 μM的SAM，得到总体积为300 μL的反应溶液2；将HAuE/H1/MCH浸入反应溶液2中，并用直流电加热电极，升高电极温度至37℃，孵育2小时，孵育完成后，取出200 μL反应溶液2，80℃灭活20分钟；将10 μL 10 μM的triDNA添加到前一步灭活的反应溶液2中，并在37℃ 600 rpm条件下孵育2 h，随后加入25 μL的10 × NEBuffer™ 2、25 μL的10 × rCutSmart™ Buffer、10 μL 10 mM的dNTP、1 μL 10000 U▪mL^-1的KFP和1 μL 5000 U▪mL^-1的Nb.BbvCI，在37℃ 600 rpm条件下反应2 h以扩增ssDNA，再在80℃条件下失活20 min，得到SDA反应后的溶液，储存在4℃以供进一步使用；

（4）Dam MTase 活性检测

将5 μL 10 μM的捕获探针H2与5 μL 10 mM的TCEP室温避光混合1小时，加入含有0.1 MNaCl的10 mM pH7.4的PBS缓冲液至混合液总体积为200 μL，然后将金电极AuE浸入其中，4℃孵育过夜，得到AuE/H2；用含有0.1 M NaCl的10 mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗AuE/H2表面后，将AuE/H2依次在0.2 mL 2 mM的MCH(0.2 mL 1 %的BSA中室温孵育1 h，得到AuE/H2/MCH/BSA；AuE/H2/MCH/BSA用含有0.1 M NaCl的10 mM pH7.4的PBS缓冲液冲洗并在氮气下干燥，将10 μL SDA反应后的溶液滴在AuE/H2/MCH/BSA的表面，在37℃条件下孵育1 h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA；将AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA浸入200 μL 37℃的SERS tag溶液中孵育2 h，得到AuE/H2/MCH/BSA/ssDNA/4-MBA/sDNA/AuNCs；将孵育后的电极用超纯水冲洗，氮气吹干，进行拉曼检测。

3.根据权利要求2所述的一种检测DNA甲基转移酶 (Dam MTase) 活性的SERS传感器的制备方法，其特征在于：所述的SDA反应所扩增的ssDNA的序列为：

5'-TGAGGTTGAAGTCTTATTGA-3'。