[发明专利]一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器

说明书

本发明公开一种检测DNA甲基转移酶活性的SERS传感器。该传感器包括金盘温控电极，金电极，限制性内切酶DpnI，聚合酶KFP，切口核酸内切酶Nb.BbvcI，基底探针H1，引发探针triDNA，捕获探针H2，信号探针sDNA和信号分子4‑MBA组装在金纳米立方块表面的SERS tag。通过提高温控金电极的表面温度，Dam MTase和DpnI的活性显着增加，从而导致SDA模板DNA的快速产生。在SDA过程中，释放的ssDNA呈指数级扩增，其浓度与Dam MTase的活性呈正相关。本发明检测限为8.65×10^‑5 U mL^‑1，低于大多数文献报道值。

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种检测DNA甲基转移酶（Dam MTase）活性的SERS传感器。

背景技术

DNA甲基化在基因转录和基因表达等许多生物学过程中发挥着重要作用。它是一种化学修饰过程，通过DNA甲基化转移酶（MTase）将S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中的甲基特异性地转移到特定DNA识别序列中的腺嘌呤或胞嘧啶上。由异常 MTase 活性引起的异常甲基化会影响基因表达并进一步导致各种癌症。因此，开发一种用于检测MTase活性和筛选其抑制剂的高灵敏度生物传感器至关重要。已经报道了许多检测MTase活性的方法，包括电化学、荧光、比色法、光电化学和表面增强拉曼光谱（SERS）。 在这些方法中，SERS 因其高灵敏度和快速读出而备受关注。

SERS作为一种强大的分析技术已被广泛研究用于检测蛋白质、小分子、核酸，因为它具有高灵敏度和快速读出的优点。SERS tag是通过将拉曼报告分子固定在等离激元贵金属纳米颗粒（如Au纳米球、Ag纳米立方体和Au纳米金星）的表面上来制造的。当拉曼报告分子位于纳米粒子周围“热点”处的极大增强电场中时，SERS强度显着增强。与球形等离子体纳米粒子相比，纳米立方体由于角和边缘的尖锐特征提供了更大的SERS增强，可以产生“避雷针”效应。此外，金纳米立方体（AuNCs）具有良好的生物相容性和长期稳定性，特别适合制备用于生物传感应用的SERS tag。然而，AuNCs尚未应用于MTase活性的SERS检测。

链置换扩增（SDA）是一种等温核酸扩增方法，可提供超过10¹⁰倍的靶标DNA扩增，并于1992年首次提出。从那时起，SDA因其快速高效的优点被广泛用于检测核酸、蛋白质和小分子。在典型的SDA过程中，主要涉及两种酶，切口内切核酸酶Nb.BbvCI和Klenow片段聚合酶（3'→5' exo-，KFP）。 Nb.BbvCI，可以识别双链DNA中5'-GCTGAGG-3'的特定序列，并在胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）之间切割一个3'-末端。KFP是从大肠杆菌中DNA聚合酶I的大蛋白水解片段的定点突变获得的，该片段保留了聚合酶的活性，但失去了3'、5'-外切核酸酶活性。在SDA过程中，KFP可以在dNTP 存在的情况下，在NB.BbvCI引起的切割位点3'-末端进行DNA聚合反应。聚合导致位于切割位点下游的靶标DNA的分离和包含靶标DNA序列的双链DNA的再生。重复切口-聚合-置换反应，导致靶标DNA的循环扩增和灵敏度的提高。

温控电极是通过施加电流直接或间接加热电极表面的一种技术。其优点在于能够在保持溶液温度不变的同时迅速提高电极温度。目前尚未报道结合链置换放大和温控电极检测Dam MTase活性的SERS 生物传感器。

发明内容