[发明专利]耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法

说明书

本发明公开了耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法。该试剂盒包括前处理液、扩增反应液和突变检测液组，所述突变检测液组选自突变检测液A、突变检测液B、突变检测液C和突变检测液D中的至少一种；所述前处理液包括Tween20、NP‑40、Triton‑X100、PVP和NaOH；所述扩增反应液包括热启动Taq酶、UNG酶、dNTP、dUTP、5×PCR缓冲液，所述5×PCR缓冲液包括Tris‑HCl、MgCl2、BSA、甘露醇、(NH4)2SO4、Tween20和海藻糖。该试剂盒对微量血样(3ul血液或者3mm干血斑)进行一步处理，处理液直接进行后续扩增检测，不需要进行基因组DNA纯化等繁琐步骤，节约成本和时间，适合新生儿干血斑筛查检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及耳聋遗传基因突变检测试剂盒、试剂组合、探针以及检测基因突变的方法。

背景技术

新生儿疾病筛查，在新生儿刚出生进行疾病的筛查和诊断，是出生缺陷三级防控重要措施，实现早发现、早诊断、早治疗，显著提高患儿预后和生活质量。耳聋是一种主要的出生缺陷，遗传因素是导致耳聋的主要原因，大量分子流行病学研究显示，GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA以及GJB3基因是中国人群最常见的耳聋遗传致病基因，这4个基因中的主要20个位点覆盖90％以上耳聋致病突变，因此临床上通常通过检测这些热点突变来进行耳聋基因检测。新生儿进行耳聋遗传基因检测意义尤为显著，将耳聋干预时间点提前，避免更多的耳聋发生。新生儿疾病筛查由各地区新生儿疾病筛查中心管理实施，通常在新生儿出生第三天采集足跟血，制作干血斑并传递到新生儿疾病筛查中心完成检测。因此，实现新生儿疾病筛查试剂盒必须是能实现通过干血斑进行检测。

对于耳聋基因进行检测方法主要有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、Taqman荧光定量、变性高效液相色谱(DHPLC)技术、等位特异性PCR、SNaP shot测序技术、高通量测序技术、基因芯片以及DNA直接测序等，这些方法一般在临床诊断实验室用的多，由于检测步骤繁琐、仪器昂贵、检测通量限制等原因，临床应用推广受到极大限制。

目前临床应用较多的耳聋基因检测试剂盒主要有北京博奥生物技术有限公司的十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒(微阵列芯片法)和潮州凯普生物的耳聋易感基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)，这两个试剂盒技术主要是液相芯片杂交的原理，实现多管PCR扩增检测15个突变热点，但这些方法需要专用仪器，价格昂贵，操作步骤多而且复杂，耗时费力，而且需要开盖处理PCR产物，极其容易引起PCR污染。

华大基因研发的耳聋基因检测试剂盒，基于高通量测序技术，虽然能检测20个突变热点，但高通量测序技术检测成本高，操作繁琐，而且需要较多样本量，并不适合大规模人群的新生儿筛查检测。

厦门大学相关专利《一种耳聋易感基因突变检测试剂盒极其制备方法与应用》(专利号CN104263848B)和深圳亚能生物《一种遗传性耳聋基因检测试剂盒》(专利号CN106811533B)，均采用荧光定量PCR平台，通过荧光探针熔解曲线方法，可同时检测20个以上突变热点，但均需使用抗凝血纯化的DNA，而新生儿筛查只能采集有限的干血斑，无法提供抗凝血，因此这两种试剂盒不适合进行新生儿耳聋基因筛查。

目前国内尚缺乏一种针对新生儿干血斑样本、操作简单、成本低、检测位点多、高通量的适合用于新生儿耳聋基因筛查的试剂盒，这极大制约了新生儿耳聋基因筛查的推广和普及。耳聋基因突变位点检测，最有意义的是新生儿筛查，因此开发直接针对干血斑样本检测的灵敏度更高的试剂盒非常有必要，随着目前新生儿筛查病种的增加，采血制作的干血斑的数量需求也相应增加，因此，开发微量干血斑样本检测技术，不增加新生儿干血斑采集数量，在现有血斑上完成检测，对新生儿普及耳聋基因遗传基因突变位点筛查检测非常重要。

发明内容