[发明专利]一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用

权利要求书

1.一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株，其特征在于，所述突变株为σ⁵⁴因子调控基因AZC_0343缺失的茎瘤固氮根瘤菌。

2.权利要求1所述突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA为模板，分别以0343-up-F/R为引物扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343-up，以0343-down-F/R为引物扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的下游片段AZC_0343-down；

(2)酶切酶连构建重组质粒pCM351::AZC_0343up-down；

(3)将上述重组质粒导入大肠杆菌DH5α，并通过三亲接合方法和同源重组原理导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；

(4)使用同时含有氨苄青霉素和庆大霉素抗性的TY固体培养基筛选阳性接合子，并通过PCR验证获得AZC_0343基因敲除的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株。

3.根据权利要求2所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物具体为：

0343-up-F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；

0343-up-R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；

0343-down-F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；

0343-down-R：GAGCTCGAGGAGCGCGTAGATGTCC。

4.根据权利要求2所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为：将步骤(1)扩增得到的所述上游片段AZC_0343-up连接到pEASY Simple上，分别用Kpn I和Nde I限制性内切酶进行酶切，收集目的片段与经Kpn I和Nde I酶切的pCM351片段连接，连接后转入大肠杆菌筛选阳性重组子，获得pCM351:AZC_0343-up质粒；

将步骤(1)扩增得到的下游片段AZC_0343-down连接到pEASY Simple上，分别用Apa I和Sac I限制性内切酶双酶切AZC_0343-down片段和pCM351:AZC_0343-up质粒，收集并将经Apa I和Sac I双酶切的AZC_0343-down片段和pCM351:AZC_0343-up质粒连接，连接后转入大肠杆菌筛选阳性重组子，获得重组质粒pCM351::AZC_0343up-down。

5.根据权利要求2所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的三亲接合方法具体指的是：将供体菌(含有重组质粒的DH5α)和辅助菌(含有辅助质粒pRK2013的DH5α)于TY液体培养基中培养，将受体菌(野生型茎瘤固氮根瘤菌ORS571)于LB液体培养基中培养，然后将供体菌、辅助菌和受体菌按3:2:1的体积比混合后于LB固体培养基中，于37℃条件下培养48h进行三亲接合。

6.根据权利要求5所述的突变株的构建方法，其特征在于，三亲接合过程中，重组质粒pCM351::AZC_0343up-down导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571并与菌株ORS571基因组靠近，两个DNA分子的同源序列自发进行重新组合得重组后的接合子。

7.根据权利要求6所述的突变株的构建方法，其特征在于，步骤(4)具体为：将步骤(3)得到的重组后的接合子在同时含有氨苄青霉素和庆大霉素的TY固体培养基上培养，筛选可以在同时含有氨苄青霉素和庆大霉素的TY固体培养基上生长的阳性接合子，通过PCR验证获得所述突变株。

8.权利要求1所述突变株在促进玉米生长中的应用。