[发明专利]一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用

说明书

本发明提供了一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用，所述突变株为AZC_0343基因缺失的茎瘤固氮根瘤菌；本发明以茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA为模板，分别以引物0343‑up‑F/R、0343‑down‑F/R扩增AZC_0343基因的上游片段和下游片段；将扩增产物酶切酶连构建重组质粒，然后将重组质粒导入大肠杆菌，并通过三亲接合方法导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；最后筛选得到所述突变株。本发明所述突变株的固氮能力显著，其固氮酶活性比野生株提升了88.56％，且所述突变株可以增加土壤养分、提高肥料有效性，促进玉米生长，具有开发成微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。

【技术领域】

本发明涉及农业微生物领域，具体涉及一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用。

【背景技术】

氮是植物生长所需的三大主要营养素之一，作物体内蛋白质、酶、核酸、叶绿素、维生素等有机化合物的合成都离不开氮的参与。氮在大气中含量丰富(占79％左右)，但大多数植物无法直接利用氮气。农业生产中施用氮肥增产是缓解耕地资源不足、保证粮食品质的重要措施；然而，随着施氮量的进一步增加，农作物产量却不再增加，并且氮效率大幅度下降。研究表明过量施氮导致玉米叶片早衰，产籽量降低；并且长期过量施用氮肥会造成土壤板结，污染环境并影响土壤微生态。因此，科学使用肥料，开发新型绿色肥料保证农田可持续生产能力，促进农业绿色发展仍然是努力的方向。

微生物肥料因具有调节植物生长、增加作物产量、改善作物品质、减少化肥使用量、改良土壤、保护生态环境等特点受到广泛关注，成为绿色生态农业发展中不可替代的制胜法宝之一。固氮细菌与植物共生固氮的过程中将大气中的氮气转化为更容易被宿主植物利用的氨。茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)属于杆菌，是从豆科植物毛萼田菁茎瘤中分离到的固氮细菌，其细胞直径大于2.0μm且长短不一，呈卵圆状或类球状，其宿主特异性很强。ORS571除了可以和宿主植物共生固氮，还能够在微耗氧的条件下自生固氮或作为内生菌在其他植物体内固氮，为宿主植物增加获取氮源的途径。由此可见，茎瘤固氮根瘤菌ORS571应用于农业，具有不可替代的研究意义。

【发明内容】

本发明的目的在于，提供一种固氮效率高、具有显著促生效果的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株、构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株，所述突变株为σ⁵⁴因子调控基因AZC_0343缺失的茎瘤固氮根瘤菌，其出发菌株为茎瘤固氮根瘤菌ORS571。

所述突变株通过以下方法构建得到：

(1)以茎瘤固氮根瘤菌ORS571为模板，分别以引物0343-up-F/R和引物0343-down-F/R扩增茎瘤固氮根瘤菌AZC_0343基因的上游片段AZC_0343-up和下游片段AZC_0343-down；

(2)酶切酶连构建重组质粒pCM351::AZC_0343up-down；

(3)将上述重组质粒导入大肠杆菌DH5α，并通过三亲接合方法和同源重组原理导入茎瘤固氮根瘤菌ORS571；

(4)使用同时含有氨苄青霉素和庆大霉素抗性的TY固体培养基筛选阳性接合子，并通过PCR验证获得AZC_0343基因敲除的茎瘤固氮根瘤菌ORS571的突变株。

优选地，步骤(1)中所述引物具体为：

0343-up-F：GGTACCGCTCCACGATCATCTGCTG；

0343-up-R：CATATGCCATCGAAATACTTGCCGAC；

0343-down-F：GGGCCCGTGGTGGTCTTCCGCCATG；