[发明专利]一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及新型冠状病毒核酸检测技术，具体涉及用于一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用，引物探针组合包括针对新型冠状病毒Delta变异株靶点设计的一对特异性扩增引物和一条特异性识别单碱基突变的检测探针，该引物和探针可与新型冠状病毒N基因和人的内标Actin基因的引物探针相组合。本发明的引物探针组合可以实现在一管反应中，同时检测样本中是否含有新型冠状病毒核酸，进一步的鉴别是否为新型冠状病毒Delta变异株。应用本发明提供的新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，对RNA核酸样本进行检测，具有特异性好、灵敏度高，以及方便、快速、准确的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及新型冠状病毒核酸检测技术，具体涉及用于一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用。

背景技术

随着新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV- 2）的不断进化和变异，相继出现多种关切变异株(Variant of concern，VOC)。其中已成为公共卫生部门和民众重点关注的VOC—新型冠状病毒Delta变异株(原称B.1.617. 2），其传播能力和致病性明显提高，并出现抗原逃逸现象，具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点。

针对新型冠状病毒Delta变异株的检测，现有技术中主要提供了新型冠状病毒ORF基因和/或N基因作为新型冠状病毒靶基因的检出，然后再通过二代测序技术（NGS）确定是否存在突变位点来鉴别Delta变异株，该方法准确度较高，但其存在的缺陷为该方法并非一次性检出，且成本高耗时久，故在实际应用中很不方便。

发明内容

为了快速有效的一步法鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Delta变异株，本发明基于Taqman荧光探针法的原理技术，针对Delta变异株的突变位点，设计了特异性好、灵敏度高的引物和探针。

本发明用于准确检测新型冠状病毒Delta变异株，现将其靶点选择做如下说明：

新型冠状病毒Delta变异株(原称B.1.617. 2）因其具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，逐渐取代其他VOC成为全球疫情流行株。新型冠状病毒Delta变异株具有L452R、P681R、T19R和T478K突变，研究显示L452R突变位于SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合区域，这对进入宿主细胞至关重要，且L452R突变增强了其膜融合活性、传染性和病毒复制能力。故本发明专利使用S蛋白上的L452R突变位点作为新型冠状病毒Delta变异株检测的靶基因（NCBI，MZ571142.1），本发明专利所提供的引物设计在包含L452R突变位点的保守区域，而特异性检测探针则设计在L452R突变位点上。

本发明提供的一种用于新型冠状病毒Delta变异株检测的探针，具有SNP分型的作用。SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）全称为单核苷酸多态性，是指在基因组上单个核苷酸的变异，变异类型包括转换、颠换、缺失和插入。SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种。目前Taqman探针法荧光定量PCR检测成为最常见的SNP分型方法之一。本发明将通过Taqman荧光探针法验证L452R碱基由T突变成G的SNP位点，实现L452R位点上单个碱基突变的检测。

本发明的第一个目的是提供用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合，其特征在于，包括一对特异性扩增引物和一条特异性识别单碱基突变的检测探针。

（1）一对特异性扩增引物，设计在包含L452R突变位点的保守区域，为有效提高目的片段的扩增效率，其设计思路为：

a、首先需要扩增产物长度80～200bp之间，最佳选择80～150bp。引物长度一般在20～25bp，但不应过长，否则延伸温度变高而影响Taq DNA聚合酶进行反应；

b、引物GC含量在40%~70%之间，且上下游引物的GC含量不能差异太大；