[发明专利]一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法

权利要求书

1.一种超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：应用ARTP诱变技术得到超高浓菌株突变体库；

步骤2：使用基于液滴微流控技术的高通量筛选方法选育超高浓酿造菌株；

步骤3：MMC微流控选育及菌株适应性驯化；

步骤4：梯度平板选育；

步骤5：糖代谢力复筛；

步骤6：优选菌株的酿造性能分析。

2.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤1的具体步骤包括：

步骤1.1：选择处于对数生长中期的出发菌株细胞进行等离子诱变，测定致死率，绘制出发菌株的等离子诱变致死率曲线，确定合适的等离子诱变时间；

步骤1.2：选择致死率在85％左右的等离子诱变时间作为诱变处理条件，对酵母菌株进行等离子诱变，依据相应的ARTP诱变条件多批次处理备选菌株，构建酵母诱变突变库。

3.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤2的具体步骤包括：

步骤2.1：连续筛选培养基，

A：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖5％(w/v)，乙醇5％(w/v)；

B：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖10％(w/v)，乙醇10％(w/v)；

C：蛋白胨2％(w/v)，酵母膏2％(w/v)，琼脂2.0％(w/v)，麦芽糖15％(w/v)，乙醇15％(w/v)；

步骤2.2：菌株接种于2mL YPD培养基中，25℃、250r/min培养14h，当OD600为0.1时转接至连续筛选培养基，12℃、250r/min培养14h，菌体洗涤重悬，当OD600为1时转接至5mL连续筛选培养基中，超声处理获得单分散的酵母细胞；

步骤2.3：采用液滴生成芯片制备单细胞液滴，其中水相为含有不同麦芽糖和酒精浓度培养基的细胞悬浮液，主要包含：20μL不同菌体浓度的单分散酵母细胞悬液，加入到连续筛选培养基中，总体积200μL；将油相和水相分别加入到1mL注射器内，注射器置于注射泵中与芯片连接，设定油相300μL/h，水相100μL/h，通过液滴制备芯片制备单细胞液滴，生成液滴直径约25μm，单细胞液滴12℃静置培养至所需时间后进行信号检测。

4.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤3的具体步骤包括：液滴静置于恒温培养箱10℃培养24h，筛选时设定液滴流速为10–15μL/h，油相流速为200–250μL/h，液滴筛选速度约250Hz，分选阈值为液滴细胞信号最高的0.1％，收集约200–250个液滴至1mL装有麦汁培养基的EP管中，分别涂布于多个高浓梯度平板中，10℃培养待长出单菌落。

5.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤4的具体步骤包括：在20-25°P梯度平板对筛选出的菌株进行分离纯化，选取在高浓区生长快速、强壮的菌落，重复三次；浓度梯度所用培养基：20P和25P麦汁添加2％琼脂，方法为先将25P培养基铺入微倾放置的培养皿内，使铺好的培养基在培养皿内一侧成15°角，等凝固后再将20P培养基铺入水平放置培养皿，直到培养基平面水平为止。

6.根据权利要求1所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤5包括α-葡萄糖苷酶活力分析和乙醇脱氢酶活力分析，通过检测糖转运关键限速酶α-葡萄糖苷酶活力，筛选抗渗透压能力高的菌株，通过检测乙醇代谢过程中乙醇脱氢酶活力，筛选抗乙醇毒性能力高的菌株。

7.根据权利要求6所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤6的具体步骤包括：对经过梯度平板筛选和糖代谢能力复筛所得菌株进行实验室规模发酵实验，验证高浓菌株酿造过程的酵母综合状态、啤酒理化风味质量，重点考察酵母增殖能力、降糖能力以及风味代谢能力，进行菌株优选，确定超高浓酿造优选菌株。

8.根据权利要求3所述的超高浓啤酒酿造菌株的高通量选育方法，其特征在于，所述步骤2.2中的超声处理使用的超声破碎仪总功率为950W，使用功率4％，超声9.9s，停9.9s，共1min。