[发明专利]RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法在审
申请号: | 202210300874.3 | 申请日: | 2022-03-24 |
公开(公告)号: | CN114574633A | 公开(公告)日: | 2022-06-03 |
发明(设计)人: | 李敏;李桂黎;杨泽晓;周立新;岳建国;黄云川;林鑫;李俐睿;周潇潇;石湉;叶斌 | 申请(专利权)人: | 成都市动物疫病预防控制中心 |
主分类号: | C12Q1/70 | 分类号: | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
代理公司: | 成都帝鹏知识产权代理事务所(普通合伙) 51265 | 代理人: | 李华 |
地址: | 610000 四川*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | rhdv2 荧光 定量 rt pcr 检测 方法 | ||
1.一种荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的引物探针组,其特征在于,所述引物探针组是由引物F、引物R和探针T组成:
所述引物F的序列为:5’-GAGTGTTGATGGRTACTTC-3’,
所述引物R的序列为:5’-CCCAAGTTGTACACAAGC-3’,
所述探针T的序列为:5’-AGCCACCCTCATYGACCTGT-3’,所述探针T的5’端标记有荧光报告基团FAM,3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
2.一种包含权利要求1所述引物探针组的时荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的试剂盒。
3.权利要求1所述引物探针组在制备用于荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的试剂盒中的应用。
4.一种用于兔病毒性出血症2型的荧光定量RT-PCR检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)按照病毒核酸提取试剂盒与反转录酶说明书提取RHDV2病毒基因组RNA,以提取的基因组RNA为模板,反转录合成cDNA,利用引物F和引物R进行PCR扩增VP60基因,克隆至T载体,构建阳性重组T载体,测序鉴定。具体步骤为:将PCR扩增产物按照试剂盒进行凝胶纯化回收,取4μL胶回收产物按照T载体连接试剂盒说明书配制反应体系,16℃连接过夜;取100μL在冰上融化的DH5a感受态细胞,加入连接产物,轻轻混匀,冰上静置25min;42℃水浴热激45~60s,迅速转移至冰浴中,静置2min;向离心管中加入700μLLB培养液,混匀后37℃,200rpm震荡培养1h;3000rpm离心5min,弃去上清700μL,将剩下的菌液轻轻混匀,吸出涂布到LB琼脂培养板(50μg/mlAmp+)上,37℃培养箱过夜培养;挑取白色单菌落到5mL LB液体培养基(50μg/mlAmp+)中,37℃培养箱过夜培养。取2μL培养物为模板,进行PCR鉴定;将PCR鉴定阳性的菌落培养物,送生物技术测序公司测序鉴定。
(2)将步骤(1)构建的阳性重组载体10倍梯度稀释,以引物F和引物R进行实时荧光定量PCR扩增,以模板浓度的Log值为纵坐标,以扩增得到的Ct值作为横坐标,制作标准曲线;
(3)提取各类样本的基因组RNA,并反转录合成cDNA,利用引物F、引物R和探针T进行实时荧光定量PCR扩增,得Ct值,然后根据步骤(2)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述反转录合成cDNA的步骤为:
反应体系为10μL,在PCR反应管中依次加入下列反应物:5×AMV反应缓冲液2μL;反转录引物50μmol/L Oligo dT 0.5μL;AMV反转录酶0.5μL;随机6核苷酸引物100μmol/L 0.5μL;无核酸酶水4.0μL;RNA模板2.5μL;混匀后瞬时离心,随后进入反转录循环37℃15min,65℃5s。
6.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述PCR扩增采用的荧光RT-PCR反应体系为:
18μL荧光RT-PCR反应混合液,组成如下:
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,所述PCR扩增的步骤为:将18μL荧光RT-PCR反应混合液加入PCR扩增管,将2μL cDNA加入PCR扩增管,加入模板后,密封PCR管,瞬时离心,将PCR扩增管放在PCR仪中,扩增程序如下:
95℃预变性3min;
95℃变性10s;
59℃退火10s,
72℃延伸25s,45个循环。
8.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,采用所述检测方法对兔出血症病毒2型进行鉴定时,方法如下:被检样品Ct值≤36且出现特异性扩增曲线,则判定兔出血症病毒2型核酸阳性;当无Ct值或Ct≥40,则判定兔出血症病毒2型核酸阴性;当36<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,则判定疑似;对疑似样品进行重复检测,结果仍为疑似,则判定为兔出血症病毒2型核酸阳性。
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