[发明专利]RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组是由引物F、引物R和探针T组成：

所述引物F的序列为：5’-GAGTGTTGATGGRTACTTC-3’，

所述引物R的序列为：5’-CCCAAGTTGTACACAAGC-3’，

所述探针T的序列为：5’-AGCCACCCTCATYGACCTGT-3’，所述探针T的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

2.一种包含权利要求1所述引物探针组的时荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的试剂盒。

3.权利要求1所述引物探针组在制备用于荧光定量RT-PCR检测兔病毒性出血症2型的试剂盒中的应用。

4.一种用于兔病毒性出血症2型的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)按照病毒核酸提取试剂盒与反转录酶说明书提取RHDV2病毒基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，反转录合成cDNA，利用引物F和引物R进行PCR扩增VP60基因，克隆至T载体，构建阳性重组T载体，测序鉴定。具体步骤为：将PCR扩增产物按照试剂盒进行凝胶纯化回收，取4μL胶回收产物按照T载体连接试剂盒说明书配制反应体系，16℃连接过夜；取100μL在冰上融化的DH5a感受态细胞，加入连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min；42℃水浴热激45～60s，迅速转移至冰浴中，静置2min；向离心管中加入700μLLB培养液，混匀后37℃，200rpm震荡培养1h；3000rpm离心5min，弃去上清700μL，将剩下的菌液轻轻混匀，吸出涂布到LB琼脂培养板(50μg/mlAmp+)上，37℃培养箱过夜培养；挑取白色单菌落到5mL LB液体培养基(50μg/mlAmp+)中，37℃培养箱过夜培养。取2μL培养物为模板，进行PCR鉴定；将PCR鉴定阳性的菌落培养物，送生物技术测序公司测序鉴定。

(2)将步骤(1)构建的阳性重组载体10倍梯度稀释，以引物F和引物R进行实时荧光定量PCR扩增，以模板浓度的Log值为纵坐标，以扩增得到的Ct值作为横坐标，制作标准曲线；

(3)提取各类样本的基因组RNA，并反转录合成cDNA，利用引物F、引物R和探针T进行实时荧光定量PCR扩增，得Ct值，然后根据步骤(2)所得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述反转录合成cDNA的步骤为：

反应体系为10μL，在PCR反应管中依次加入下列反应物：5×AMV反应缓冲液2μL；反转录引物50μmol/L Oligo dT 0.5μL；AMV反转录酶0.5μL；随机6核苷酸引物100μmol/L 0.5μL；无核酸酶水4.0μL；RNA模板2.5μL；混匀后瞬时离心，随后进入反转录循环37℃15min，65℃5s。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的荧光RT-PCR反应体系为：

18μL荧光RT-PCR反应混合液，组成如下：

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的步骤为：将18μL荧光RT-PCR反应混合液加入PCR扩增管，将2μL cDNA加入PCR扩增管，加入模板后，密封PCR管，瞬时离心，将PCR扩增管放在PCR仪中，扩增程序如下：

95℃预变性3min；

95℃变性10s；

59℃退火10s，

72℃延伸25s，45个循环。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，采用所述检测方法对兔出血症病毒2型进行鉴定时，方法如下：被检样品Ct值≤36且出现特异性扩增曲线，则判定兔出血症病毒2型核酸阳性；当无Ct值或Ct≥40，则判定兔出血症病毒2型核酸阴性；当36＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，则判定疑似；对疑似样品进行重复检测，结果仍为疑似，则判定为兔出血症病毒2型核酸阳性。