[发明专利]一株产L-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用

说明书

本发明公开了一株产L‑乳酸的酿酒酵母的改造及其应用，属于定向代谢技术领域。本发明以酿酒酵母TJG12作为出发菌株，通过敲除酿酒酵母TJG12中的NADH脱氢酶NDE1和NDE2以及苹果酸脱氢酶1，并增强了苹果酸脱氢酶2的表达，同时异源表达来源于大肠杆菌的6‑磷酸果糖激酶pfkA及来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶LLDH等改造，提升了酿酒酵母对L‑乳酸的生产性能，可使摇瓶产量从29.5g/L提升至47.7g/L。有利于进一步提升L‑乳酸的生产性能。

技术领域

本发明涉及一株产L-乳酸的酿酒酵母的改造及其应用，属于定向代谢技术领域。

背景技术

近年来，随着生物可降解高分子材料-聚乳酸的需求不断增加，以及可直接参与人体代谢的特异性，L-乳酸在环保及食品中的应用日益引起人们的关注。L-乳酸发酵合成过程中，为了平衡不断降低的pH，常需要补加中和剂，如CaCO₃、NaOH、Ca(OH)₂等来中和所产生的乳酸。而在产物提取过程中，又需要用浓H₂SO₄将乳酸盐进行酸化，置换出乳酸，同时形成大量CaSO₄的废杂，不仅工序复杂而且对环境造成极大的污染。酵母菌能够耐受较低的pH环境，为开发在不补加中和碱的工艺下进行有机酸发酵的工业菌种提供了可能。鉴于酿酒酵母具有遗传背景清晰、耐受性强、食品安全性、利用廉价底物生产有价值物质方面的诸多优势，并随着分子生物学技术的发展，利用代谢工程改造酿酒酵母本身固有的代谢网络，使其高产L-乳酸已成为当前研究的热点。

酿酒酵母自身并不含有生产L-乳酸的乳酸脱氢酶LDH，仅在酿酒酵母中表达外源LDH得到的L-乳酸积累量都不高，需要通过代谢工程手段进一步提高产率。利用代谢工程技术对细胞代谢进行修饰与改造，定向改变细胞特性，是一种生产各类化学物质的重要方法。在改造酿酒酵母生L-乳酸方面已实现L-乳酸的积累，产率的提高，同时副产物明显降低。但是改造菌株生长能力降低的问题还需解决，而且酿酒酵母工程菌株的L-乳酸产量也未能达到乳酸菌菌株的L-乳酸产量水平，乳酸生产菌株还有待进一步的开发和改造以提升L-乳酸的生产。

发明内容

为解决上述酿酒酵母异源基因表达效率低，产量不高等问题，本发明提供一种利用Yeast8.4.0模型筛选高产L-乳酸关键代谢调控基因MDH1、MDH2、pfkA、NDE1和NDE2，以提高酿酒酵母菌中L-乳酸产量的方法。利用基因工程手段分别调控了同工酶MDH1(质粒中表达)和MDH2(胞质中表达)，二者是同工酶但在模型约束中属竞争关系，模拟结果为在胞质中的MDH2更好利用；表达外源磷酸果糖激酶(大肠杆菌)pfkA基因，提升能量供应的能力；敲除NADH脱氢酶NDE1、NDE2，减少NADH的消耗。

本发明的第一个目的是提供一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母敲除了苹果酸脱氢酶1、NADH脱氢酶，并过表达苹果酸脱氢酶2、来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶，并表达来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶。

过表达苹果酸脱氢酶2；

过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶并敲除苹果酸脱氢酶1；

过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶并敲除苹果酸脱氢酶1及NADH脱氢酶NDE1；

过表达苹果酸脱氢酶2、异源表达来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶，并敲除苹果酸脱氢酶1、NADH脱氢酶NDE1和NDE2。

在一种实施方式中，将所述来源于乳酸乳球菌的乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶整合至酿酒酵母基因组的NADH脱氢酶NDE1位点以敲除NADH脱氢酶NDE1并实现所述乳酸脱氢酶和来源于大肠杆菌的磷酸果糖激酶的表达。