[发明专利]高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法

权利要求书

1.高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)采集生物组织或细胞样品；

2)组织切成小块或细胞离心沉淀后，在高压冷冻仪中进行高压冷冻固定；

3)将样品转入冷冻替代仪中，在低温下进行醋酸双氧铀溶液固定和丙酮脱水；

4)在冷冻替代仪中，进行乙醇冲洗和梯度浓度的HM20树脂渗透与包埋，紫外光下完成对HM20树脂的低温聚合固化。

2.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤1)中，所述样品包括动物、植物和酵母等的生物组织或细胞样品。

3.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤1)中，所述样品的厚度为200μm以下。

4.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤1)中，所述采集的具体方法为：对于生物组织，首先将动物或植物的组织在尽可能鲜活的状态下，快速切成厚度小于200μm小块；对于细胞样品，包括动物细胞、植物细胞或酵母，则分别通过转速为300～350xg、70～100xg和3000xg离心5～10min沉淀收集。

5.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤2)中，所述高压冷冻固定，样品在尽可能鲜活的状态下放入高压冷冻仪中进行固定。

6.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤2)中，所述高压冷冻固定的具体方法为：将样品迅速放入高压冷冻仪的承载容器中，容器中未填满的部分加入原细胞或组织培养液、十六碳烯、10％～20％牛血清白蛋白(动物样品适用)或0.1～0.15M的蔗糖溶液(植物样品适用)，避免空气残留；利用高压冷冻仪可在2100bar的压力下，在毫秒级时间内利用液氮对细胞或组织样品快速冷冻固定，样品冷冻速率为12000K/s～25000K/s，从而捕捉细胞内的精细结构。

7.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤3)中，所述醋酸双氧铀溶液的浓度为0.1％～0.5％，优选为0.33％；所述醋酸双氧铀固定和丙酮脱水的时间为3～72h，优选为72h；所述低温的温度范围为-90～-80℃，优选-85℃。

8.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于所述醋酸双氧铀溶液可由以下方法配制：先将醋酸双氧铀溶于适量甲醇中配制成质量百分比15％～25％的醋酸双氧铀/甲醇溶液，优选为20％；然后将适量醋酸双氧铀/甲醇溶液溶于丙酮中配制成醋酸双氧铀终浓度为0.1％～0.5％的工作溶液，优选为0.33％。

9.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤4)中，所述进行HM20树脂渗透与包埋的温度为-55～-45℃，优选-50℃；所述低温聚合的温度为-40～-30℃，优选-35℃；所述HM20树脂的梯度浓度范围为33％～100％，优选梯度浓度依次为33％、66％、100％。

10.如权利要求1所述高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，其特征在于在步骤4)中所述HM20树脂混合物由交联剂D、单体E和引发剂C组成；配置HM20树脂混合物所需交联剂D、单体E和引发剂C的质量比为(2.5～3.5)︰(11.3～22.7)︰(0.07～0.13)，优选为2.98︰17.02︰0.10。