[发明专利]高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法

说明书

高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法，涉及透射电子显微镜生物样品的制备技术。步骤：1)采集生物组织或细胞样品；2)组织切成小块或细胞离心沉淀后，在高压冷冻仪中进行高压冷冻固定；3)将样品转入冷冻替代仪中，在低温下进行醋酸双氧铀溶液固定和丙酮脱水；4)在冷冻替代仪中，进行乙醇冲洗和HM20树脂渗透与包埋，紫外光下低温聚合。可广泛应用于源于动物、植物和酵母等生物的组织或细胞样品。避免传统常温化学固定对样品结构产生的影响，最大限度保证样品结构特征，做到最真实地反映样品特性。最大限度地保护蛋白免疫原特性，使所得到的样品可进一步被抗体标记，极大地方便后期蛋白标记的实验开展。

技术领域

本发明涉及透射电子显微镜生物样品的制备技术，尤其是涉及一种高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法。

背景技术

电子显微镜是一种可以在纳米维度观察生物组织或细胞样品的超显微结构的仪器。通过其所得到的电子显微镜图片在医疗诊断、科学研究中都起着非常重要的作用。样品制备是生物成像的第一步，而样品的好坏在很大程度上影响最后电子显微镜的成像结果。制备失败的样品必定无法获得满意的图像，而良好制备的样品则是获得满意图像的重要一步。目前常用的透射电子显微镜样品固定方法包括化学固定法和冷冻固定法。

化学固定法因其操作简单被广泛使用，其主要原理是利用化学试剂与样品中的氨基酸、蛋白质和脂类之间形成交联，通常是以共价键的形式，从而固定样品。常用的初次化学固定剂包括戊二醛、甲醛或丙烯醛等，二次固定剂则以四氧化锇最为常见。固定后，样品通过使用梯度系列的乙醇、甲醇或丙酮溶液来完成脱水。切片前，样品需要先嵌入树脂中，这通常需要花费数小时至数日时间。目前常用梯度树脂替代的方法来进行样品的渗透并使用热或紫外光进行聚合。最后，样品进行切片后置于电子显微镜中成像。但化学固定法通常会导致蛋白质变性，因此利用该方法制得的样品无法进行免疫学标记。此外，化学固定剂通常需要数小时才能完全渗透进样品完成固定步骤，而在此期间样品可能已经发生了组织降解等生理变化，使最终观察到图片的准确性大打折扣。因此，对更为快速且对样品影响较小固定方法的需求迫在眉睫，而冷冻固定法则应运而生。

常用的冷冻固定法包括直插式冷冻法和高压冷冻法，主要取决于样品的厚度而进行选择，对于样品厚度小于10μm的样品，可以使用直插式冷冻法，将含样品的栅格快速地插入由液氮冷却的乙烷中完成固定。而对于样品厚度大于10μm的样品，在常压下通过骤冷无法获得足够高的冷却速率，而缓慢的冷冻速度会导致冰晶的形成从而破坏样品的显微结构，故无法使用直插式冷冻法固定厚度大于10μm的样品。而增大压力则可提高冷却速率，这使得厚度大于10μm而小于200μm的样品也能在冷冻状态下进行固定。在这里，样品在2100bar下被快速冷冻固定，这样的冷冻速度使样品中的水形成玻璃化的冰，而不会损伤样品。固定后，样品脱水步骤在低温中通过使用丙酮或乙醇来完成。切片前，样品同样需要在保持低温的环境下嵌入低温树脂，而后树脂在紫外光下进行聚合，包埋后有硬度的样品可在切片后放于透射电子显微镜观察。

目前，在医院和科研院所，常规电子显微镜的样品固定都是通过传统化学试剂在常温完成的。然而化学固定过程十分缓慢，样品可能在固定过程中已发生生理变化，不能很好的保存样品的结构特征，故所得到的结果并不完全可靠。化学固定法会造成细胞结构的收缩，细胞内容物的降解等结构假象，从而丢失细胞结构的真实生理状况下的高分辨信息。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供针对不同样品的合适参数区间，可极大减少使用者自己试错的时间，提高实验效率，降低试验过程的花费，同时改进优化高压冷冻和冷冻替代过程，最大限度地保证样品的结构并且保留蛋白抗原特征，扩大样品后续实验可行性的一种高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法。

本发明包括以下步骤：

1)采集生物组织或细胞样品；

2)组织切成小块或细胞离心沉淀后，在高压冷冻仪中进行高压冷冻固定；