[发明专利]高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种高产罗克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SpoⅢD和/或Spo0AⅡ所得。

2.根据权利要求1所述的高产罗克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述负调控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的高产罗克霉素的基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌Bs916。

4.一种权利要求1所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以SpoⅢD，Spo0AⅡ编码基因为模板设计引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，扩增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；

(2)同源重组质粒载体pMUTINSpoⅢD的构建：扩增的SpoⅢD基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSpoⅢD；

(3)同源重组质粒载体pUCSCSpo0AⅡ的构建：扩增的Spo0AⅡ基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pUCSCSrf中，构建同源重组整合质粒载体pUCSCSpo0AⅡ；

(4)SpoⅢD基因失活突变菌株ΔSpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pMUTINSpoⅢD转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的SpoⅢD基因失活突变株ΔSpoⅢD；

(5)Spo0AⅡ基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916得到高产罗克霉素的Spo0AⅡ基因失活突变株ΔSpo0AⅡ；

(6)SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD的构建：将构建好的重组质粒pUCSCSpo0AⅡ转化至枯草芽孢杆菌Bs916突变株ΔSpoⅢD中得到高产罗克霉素的SpoⅢD与Spo0AⅡ双基因失活突变菌株ΔSpo0AⅡ+SpoⅢD。

5.根据权利要求4的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的引物为SpoⅢD-F(5’-TTTAAGCTTAAAAGAACCGGCGGAATCGT-3’)和SpoⅢD-R(5’-TTTGGATCCCTGACATTTCCGCTTACCTG-3’)用于扩增SpoⅢD基因片段；Spo0AⅡ-F(5’-TTTAAGCTTCTTTTCCCGCTTGTCTTCTC-3’)和Spo0AⅡ-R(5’-TTTGGATCCTTCTTGTACTTTAGTTTCGT-3’)用于扩增Spo0AⅡ基因片段。

6.一种权利要求1所述高产罗克霉素的基因工程菌在发酵生产罗克霉素中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵为通过基因工程菌进行发酵罐发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在35-38℃，溶氧在25-35％之间；发酵周期40-50h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖10g/L，麦芽糖浆40-50g/L，玉米浆15-20g/L，尿素0.6-0.8g/L，K₂HPO₄ 7g/L，MgSO₄·7H₂O 0.35g/L，FeSO₄·7H₂O 10mg/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1-3mg/L，pH 7.0-7.2。

9.一种权利要求1所述高产罗克霉素的基因工程菌在制备用于克氏原螯虾白斑综合征的防治生物试剂中的应用。

10.一种SpoⅢD和/或Spo0AⅡ编码基因在调控枯草芽孢杆菌罗克霉素产量中的应用。