[发明专利]高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用，该基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控SpoⅢD和/或Spo0AⅡ基因所得。本发明的基因工程菌株发酵生产罗克霉素的产量是菌株Bs916的13.8倍，在5L发酵罐40‑50h可稳定生产罗克霉素，产量达到45‑50mg/L，该罗克霉素高产基因工程菌及其构建方法为加速罗克霉素的产业化提供原材料，同时高产罗克霉素的基因工程菌可用于制备克氏原螯虾WSSV的防治生物试剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产罗克霉素的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是饲料添加剂使用芽孢杆菌之一，其最大的优势是其产生的芽孢不仅耐热、而且抗逆，因此在自然界广泛分布。它可以产生多种抗菌物质，脂肽类抗生素是其中一种。经研究发现，生防枯草芽孢杆菌Bs916可以合成表面活性素、伊枯草素、泛革素和罗克霉素这四大脂肽类抗生素家簇，被认为是研究脂肽类抗生素的优良菌株。由于脂肽类抗生素可以广范围抑制细菌、对抗病毒、治疗肿瘤以及调节免疫活性，在生物行业、制药领域、农药研发领域以及工业生产上都具有广泛的应用价值。

罗克霉素是从生防枯草芽孢杆菌中分离出来的一组含有9个氨基酸寡肽头部和13～15个脂肪酸碳链尾巴的新型环脂肽类抗生素。罗克霉素是一种极具研究价值的抗生素，具体表现在罗克霉素具有明显的抑制细菌及病毒特性及较低的溶血性，因此在生物医药、工业、农业、养殖业等领域中都具有很好的应用前景。申请人前期研究显示罗克霉素在Bs916中的产量极低，仅达到3.6mg/L，这是限制其应用的最大瓶颈。因此，进一步了解其合成调控机理，构建高产工程菌具有重要的意义。

WSSV全称为white spot syndrome virus，即白斑综合征目前针对该疾病并没有有效的治疗手段，养殖业中也多以预防为主，其中免疫调节剂被认为是一种环境友好型、可操作实施的手段。现有治疗白斑综合征的手段包括使用多种敏感抗生素，这可能导致严重的问题，如：病原菌的抗药性、药物在鱼体中的残留、环境污染等。与此同时，与抗生素相比，疫苗接种具有安全性、环境友好性、长期疗效保护性的优势，但是疫苗的操作性不强，使用疫苗较为繁琐，且直接投撒进河道，疫苗失活较快，对水生动物免疫调节不起作用。

免疫调节剂是调节细胞免疫和体液免疫功能的制剂，已有研究证实中草药提取成分、益生菌及其所产生的活性抗菌肽能够有效应用于防治白斑综合征。

发明内容

发明目的：针对目前对罗克霉素调控机理认识不清，且现有菌株生产罗克霉素的产量甚少，限制其广泛的运用，本发明提供一种高产罗克霉素的基因工程菌，本发明通过对以枯草芽孢杆菌Bs916基因组中负调控基因SpoⅢD及Spo0AⅡ基因进行敲除或者缺失构建得到了全新的高产罗克霉素的基因工程菌。

本发明还提供所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法与应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种高产罗克霉素的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株，敲除或者失活菌株基因组中负调控基因SpoⅢD和/或Spo0AⅡ所得。

其中，所述负调控基因SpoⅢD，Spo0AⅡ的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。

其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bs916。

本发明所述高产罗克霉素的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以SpoⅢD，Spo0AⅡ编码基因为模板设计引物，以枯草芽孢杆菌Bs916的基因组DNA作为模板，扩增到部分SpoⅢD，Spo0AⅡ基因片段；

(2)同源重组质粒载体pMUTINSpoⅢD的构建：扩增的SpoⅢD基因片段经过双酶切，然后连接到经过同样双酶切的质粒载体pMUTINLoc中，构建同源重组整合质粒载体pMUTINSpoⅢD；