[发明专利]禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物及其检测方法

说明书

本发明公开了禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物及其检测方法，属于微生物的测定或检验方法技术领域。本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的引物及探针组合物，所述引物及探针组合物包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。本发明提供的用于检测禽呼肠孤病毒的引物及探针组合物具有高度的灵敏性，检测线可为10copies_.μL^‑1，同时具有良好的特异性和重复性。适用于生产实践中禽呼肠孤病毒的检测。

技术领域

本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及禽呼肠孤病毒微滴数字PCR检测引物组合物及其检测方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)，正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)的双链RNA病毒，能够引起禽类病毒性关节炎、腱鞘炎、免疫抑制等疾病。ARV在商品禽类中极其常见，其大部分毒株无致病性，但和其他病原微生物混合感染将会造成严重的后果，在病死鸡中一般都能分离出ARV。因此对于ARV的防控检测尤为重要。

微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)具有灵敏度强、准确度高、可绝对定量且快速等优点。目前ddPCR已广泛应用在基因突变、病原微生物、转基因食品、肿瘤相关基因检测等多方面，尚未见该技术应用在检测ARV病毒的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的检测样品是否感染禽呼肠孤病毒。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供检测或辅助检测禽呼肠孤病毒的数字PCR试剂或试剂盒，所述数字PCR试剂或试剂盒包括禽呼肠孤病毒引物探针，所述禽呼肠孤病毒引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1第472-551位的DNA片段在内的禽呼肠孤病毒基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1第472-551位的DNA片段特异结合的探针组成。

进一步地，上述的数字PCR试剂或试剂盒中，所述禽呼肠孤病毒引物探针包括引物ARV-F和引物ARV-R、探针ARV-Probe，

所述引物ARV-F为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的单链DNA或其衍生物；

所述引物ARV-R为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的单链DNA或其衍生物；

所述探针ARV-Probe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.4。

本发明中，所述ARV-Probe为特异性识别禽呼肠孤病毒的探针，所述ARV-Probe的5'端连接有荧光基团，3'端连接有淬灭基团。

荧光基团可选自但不限于FAM(5/6-羧基荧光素)、VIC(绿色荧光蛋白)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、Cy3、TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)、ROX(羧基-X-罗丹明)、Texas Red、LC RED640、Cy5(花菁燃料)、LC RED705、FITC(异硫氰酸荧光素)等常见荧光基团，进行双重PCR检测引物组合物中探针的荧光基团的选择原则是两个荧光的显色不同即可。

所述淬灭基团可选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。

进一步地，上述的数字PCR试剂或试剂盒中，所述ARV-F、ARV-R、ARV-Probe的物质的量比值为4:4:1。

进一步地，上述的数字PCR试剂或试剂盒中，所述数字PCR试剂或试剂盒还包括阳性标准品质粒。