[发明专利]微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的组合物及其应用

说明书

本发明公开了微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的组合物及其应用，属于微生物的测定或检验方法技术领域。该组合物包括鸡毒支原体特异引物探针，所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的鸡毒支原体基因组DNA片段的引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。本发明提提供的ddPCR检测的组合物灵敏性高，特异性强，适用于低拷贝样品的检测。

技术领域

本发明属于微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及微滴式数字PCR检测鸡毒支原体的方法。

背景技术

微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近几年出现的新一代聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术。通过油包水技术将反应液分割为数万个纳米级大小的微滴，每一个微滴都是一个独立的PCR反应体系，当PCR扩增完成后，利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，再根据统计学中的泊松分布原理分析阳性微滴的个数与比例，即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现对低至单个拷贝核酸分子的绝对定量。与传统实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)方法相比，它不依赖于标准曲线，因而定量结果更为精确，同时也使体系受反应抑制因子的影响大大降低。

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticam，简称MG)常常引起鸡的慢性呼吸道传染病，各种鸡均可感染且感染率高，以呼吸道发生罗音、咳嗽、流鼻液和窦部肿胀为特征。与其他呼吸道病原如禽流感、新城疫等引起的症状相似水，给MG的诊断带来困难，需要通过实验室方法进行区分，但在病毒载量较低的情况下，常规的方法也很难进行诊断，需要找到一种对低拷贝的检测方法。ddPCR方法的出现，满足了对低拷贝又能绝对定量检测的要求，因此建立ddPCR方法检测MG很有现实意义。

自1985年聚合酶链反应(PCR)检测问世以来，已被广泛应用于生物学、医学等各个领域。随着生物技术的飞速发展和技术进步，PCR技术已发展到荧光定量PCR(qPCR)技术，现今又发展到微滴数字PCR(ddPCR)技术。ddPCR技术是将样品分为油包水型的数百个甚至数百万个独立的反应单元，进而对所有独立的反应单元中包含或者不包含1个或多个拷贝的DNA模板分子进行平行扩增，在扩增结束后读取各个反应单元的阴性或者阳性荧光信号采用终点定量的方法进行分析，按泊松分布的统计学方法计算出原始样本的模板拷贝数从而达到绝对定量的目的。

ddPCR与qPCR相比具有较高的灵敏度，在样品浓度较低时能识别目的片段，不需要通过扩增反应的CT值和标准曲线来实现核酸定量。近几年，ddPCR技术已开始在动物疫病检测中发挥了作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速、准确的检测样品是否感染鸡毒支原体。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供检测或辅助检测鸡毒支原体的组合物，所述组合物包括鸡毒支原体特异引物探针，所述鸡毒支原体特异引物探针由特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段在内的鸡毒支原体基因组DNA片段的PCR引物和与核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA片段特异结合的探针组成。

进一步地，上述的组合物中，所述PCR引物由MG-F和MG-R组成，所述探针为MG-Probe，

所述MG-F为核苷酸序列是SEQ ID No.2的单链DNA；

所述MG-R为核苷酸序列是SEQ ID No.3的单链DNA；

所述MG-Probe的核苷酸序列是SEQ ID No.4。

进一步地，上述的组合物中，所述MG-F、MG-R、MG-Probe的物质的量比值为2:2:1。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供上述的组合物在如下A1)-A6)中的应用：