[发明专利]一种快速检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种快速检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条，其特征在于：它包括PVC底板(1)、样品垫(2)、金标垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)；所述PVC底板(1)的一端粘附有所述样品垫(2)，其另一端粘附有所述吸水垫(5)，其中部依次粘附有所述金标垫(3)与所述硝酸纤维素膜(4)；所述金标垫(3)的一端与所述样品垫(2)相粘附，其另一端与所述硝酸纤维素膜(4)相粘附，所述硝酸纤维素膜(4)与所述吸水垫(5)相粘附；

所述金标垫(3)包被了胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体；

所述硝酸纤维素膜(4)上沿样品流动方向依次设有检测线(41)和质控线(42)；所述硝酸纤维素膜(4)的检测线(41)包被多杀性巴氏杆菌荚膜糖蛋白，所述硝酸纤维素膜(4)的质控线(42)包被羊抗兔IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于：所述胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体的包被浓度为2～20μg/mL。

3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜(4)上多杀性巴氏杆菌荚膜糖蛋白的包被浓度为0.1～1mg/mL。

4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于：所述硝酸纤维素膜(4)上羊抗兔IgG抗体的包被浓度为0.2～2mg/mL。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)多杀性巴氏杆菌荚膜糖蛋白的提取；

(2)兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记；

(3)胶体金试纸条的组装：制备样品垫；将标记好的金标兔抗鸭IgG抗体喷涂于封闭好的结合垫上制得金标垫；用喷膜系统将多杀性巴氏杆菌荚膜糖蛋白喷涂于NC膜上的检测线，用喷膜系统将羊抗兔IgG抗体喷涂于NC膜上的质控线制得硝酸纤维素膜(NC膜)；将制得的样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次粘贴于PVC底板(1)上，得所述胶体金试纸条。

6.根据权利要求5所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(1)多杀性巴氏杆菌荚膜糖蛋白的提取的具体操作方法为：

1.1培养基配制：制备TSA平板、马丁肉汤以及脱膜液；

1.2细菌培养：

多杀性巴氏杆菌CVCC44801株冻干粉，加少量马丁肉汤溶解，挑取少量接种于TSA平板，37℃培养16h；挑取圆形突起，表面光滑湿润，边缘整齐，半透明露珠样的菌落3～5个，接种于500mL马丁肉汤中，37℃培养16h；

1.3荚膜糖蛋白的提取

培养好的菌液离心，8000r/min离心20min，弃上清；加入200mL脱膜液，于56℃水浴不间断搅拌1h；脱膜后的液体浸泡于冰水中，维持6h，期间适当搅拌；4℃下8000r/min离心50min，取上清，透析后即为荚膜糖蛋白，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定蛋白浓度。

7.根据权利要求5所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(2)兔抗鸭IgG抗体的胶体金标记的具体操作方法为：

2.1胶体金的制备

取1mL 10g/L氯金酸溶液加入到经泡酸和硅化处理过的锥形瓶中，加入100mL去离子水，锡箔纸封口，放入到微波炉中；高火3min使溶液煮至沸腾，取出锥形瓶，迅速加入10g/L柠檬酸三钠溶液1.5mL，同时混匀；溶液会从淡黄色变为无色，再变为灰黑色；锡箔纸封口，将锥形瓶放入到微波炉，中高火加热3min，溶液变为酒红色后，再加热3min，待其冷却至室温后，用去离子水补至100mL，使用450nm滤膜过滤后，4℃避光保存。

2.2胶体金标记

将制备好的胶体金于4℃3000r/min离心20min，取上清，用0.1mol/L的K₂CO₃溶液调pH至8.5；在磁力搅拌器上，按50μg/mL的比例，加入兔抗鸭IgG抗体，室温搅拌20min，静置10min，加入50g/L的BSA溶液，使其终质量浓度为10g/L，继续搅拌20min；此即为胶体金标记的兔抗鸭IgG抗体，4℃保存。