[发明专利]一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法

权利要求书

1.一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.40-0.60时，降温至21-23℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养20-24h；

培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5-1.0g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：

将pQE-60质粒用BspEⅠ和AflⅢ双酶切，再连接上序列如SEQ ID NO.5所示的片段，构建得到质粒pQE-N，所述质粒pQE-N的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；用AccⅢ和SphⅠ对质粒pQE-N双酶切，再将SEQ ID NO.4所示的编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pQE-ppk1，所述重组表达载体pQE-ppk1的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；

将获得的重组表达载体pQE-ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液的接入量为发酵培养基重量的4-8％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养基的组成为：所述发酵培养基的组成为：蛋白胨2.5g/L、脱脂豆粉20g/L、葡萄糖5g/L、甜菜糖蜜5g/L，酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料的组成为：葡萄糖200g/L、甜菜糖蜜200g/L、酵母膏80g/L、脱脂豆粉60g/L。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。