[发明专利]一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法

说明书

本发明公开了一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.40‑0.60时，降温至21‑23℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养20‑24h；培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5‑1.0g/L；(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。本发明通过对聚磷酸盐激酶1进行突变处理，提高了聚磷酸盐激酶1的酶活；并构建了聚磷酸盐激酶1突变体的发酵生产体系，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。

背景技术

多聚磷酸盐(polyphosphate，poly P)作为一种广泛存在的线性多聚体，由几个至数百个磷酸盐残基通过与ATP磷酸酐键相同的的高能磷酸键相互聚合形成。近年来研究发现，poly P不仅是生物体中不可或缺的生物能和磷酸基团储存库、负电荷密度高的生物大分子，还在微生物中参与调节基因表达、调控细菌离子通道和DNA摄取、代谢等，并与哺乳动物中瞬时电位的调节、线粒体代谢、细胞钙化等生理过程有着密切的关系。

聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，PPK1)是poly P合成代谢的关键酶。PPK1通过催化ATP末端的磷酸基团转移到磷酸盐上而形成多聚磷酸盐这一可逆反应的发生，从而将磷酸盐聚集形成多聚磷酸盐。此外，PPK1还是生产腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP)等产品都会用到的一种酶。因此，PPK1具有广阔的应用前景，市场需求较大。

但是，现有PPK1的酶活一般在650U/mg左右，仍有待进一步的提高；并且PPK1对pH控制较为严格，在生产5＇-单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，PPK1和腺苷激酶的最适pH不同但需要混合投料，这进一步影响了PPK1在实际应用中酶活的发挥。此外，目前还很少见有实现工业化发酵生产PPK1的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法。本发明通过对聚磷酸盐激酶1进行突变处理得到聚磷酸盐激酶1突变体，提高了聚磷酸盐激酶1的酶活；并构建了聚磷酸盐激酶1突变体的发酵生产体系，实现了聚磷酸盐激酶1突变体的工业化生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体的方法，包括以下步骤：

(1)将聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧(DO)为20-40％；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.40-0.60时，降温至21-23℃，向体系中加入IPTG进行诱导培养，诱导培养20-24h；

培养过程监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的残糖浓度保持在0.5-1.0g/L；

(2)将诱导培养后的培养物进行破菌处理，分离收集上清，即生产得到含有聚磷酸盐激酶1突变体的培养液。

优选的，步骤(1)中，所述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌由如下方法构建而成：