[发明专利]一种基于DNA模板的长链TNA合成方法

说明书

本发明公开了一种基于DNA模板的长链TNA合成方法。该方法属于非天然核酸合成技术领域，具体步骤：获得DNA模板及对应引物；配置TNA引物延伸的反应体系；特定温度下进行以DNA为模板的TNA引物延伸反应；取小部分反应产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验，检验引物延伸反应是否成功进行；TNA产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，分离模板DNA和TNA，切胶回收TNA。相比于固相合成，本发明可以有效地合成长达300nt的TNA，大幅提高了TNA合成的长度上限，并降低了合成的成本。为较长的TNA合成提供了优良的合成方式，支持了TNA在分子生物学中的研究和应用。

技术领域

本发明属于非天然核酸TNA合成技术领域，涉及一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，更具体的是；涉及一种通过工程化改造的聚合酶以DNA模板合成长单链苏糖核酸(TNA)的方法。

背景技术

苏糖核酸(TNA)是一种非天然核酸，它可与DNA或RNA形成稳定的双螺旋结构，同时能够储存和传递遗传信息。由于TNA化学结构简单，结构与天然核酸不同，因此TNA更耐受核酸酶的降解，在苛刻条件下更加稳定，在细胞环境中能更稳定地发挥作用。基于此，TNA在生物学、医学领域中有巨大的应用潜力。目前，已有研究筛选得到TNA酶和TNA适体。

固相合成受限于长度，目标TNA链越长，合成产率边际递减，成本边际提高。因此，固相合成不适用于长链TNA的合成，限制了TNA在不同领域的研究。

针对以上问题，开发一种成本更低，产率更高，且可以大规模合成TNA长链的合成技术是研发重点。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供了一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，具体是一种基于DNA模板、通过聚合酶催化的长链TNA分子合成方法，该发明可以实现较长的TNA链合成，相比于固相合成成本更低、产率更高。

技术方案：本发明所述的一种基于DNA模板的长链TNA合成方法，其具体操作步骤如下：

(1)、选择特定的TNA的序列；

(2)、通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板；

(3)、配置TNA延伸的反应体系，进行TNA延伸；

(4)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验所获得的TNA；

(5)、通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶回收TNA。

进一步的，在所述步骤(1)中，选择特定的TNA的序列是TNA酶、TNA适体或是和体内RNA形成互补配对可进行基因沉默的TNA中的一种；

包括核酸酶、干扰序列及适体。

进一步的，在所述步骤(2)中，通过固相合成等方法获得TNA对应的DNA模板具体是通过固相合成获取所需的DNA模板，或使用聚合酶合成、酶切等方法获得所需的单链DNA片段作为模板。

进一步的，在所述步骤(3)中，进行TNA延伸的具体操作方法是：

首先，利用获得的DNA模板和引物，与水和反应缓冲液混合，后在90℃下退火至4℃，置于冰上；

然后，加入Mn²⁺离子和Kod-RI DNA聚合酶；

最后，加入苏糖核苷三磷酸，在55℃下进行引物延伸反应，即TNA转录。

进一步的，在所述步骤(4)中，进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验具体是：通过红外荧光扫描成像仪观察DNA引物部分有Cy5.5荧光基团的TNA链延伸情况，检验转录是否成功。