[发明专利]一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：培养诱导、破菌和分离纯化，所述分离纯化依次包括离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析。本发明将离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析相结合为组合层析法，即将这三种方法的优点结合起来进行重组PCT蛋白分离纯化，得到的PCT蛋白的纯品纯度大于90％，纯度高为建立免疫学检测方法提供原材料，具有重要意义。离子交换层析、疏水层析和凝胶层析的顺序及实验条件是实现PCT蛋白纯度达到90％以上的关键点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是人11号染色体中降钙素原基因表达的产物。目前PCT的分离纯化技术主要为疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析以及亲和层析。

疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。该技术虽然操作成本低，但得到的PCT蛋白得率较低、纯化速度不高、纯度较低，活性不高。

离子交换层析是根据蛋白表面带电量不同进行蛋白质的分离纯化技术。该技术得到的PCT蛋白纯度不高、活性较差。凝胶过滤层析是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离纯化。该技术虽然操作条件较温和，但是凝胶载量低、选择性差，纯化速度较低。

亲和层析是利用目标蛋白与亲和载体配基有较强的吸附力，从而将目标蛋白与其他物质分离目的。此技术虽然可以有效避免蛋白的活性，但目标蛋白分离纯化实验条件要求高。

本发明将离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析组合进行PCT蛋白分离纯化，充分利用每种方法的优势，使得到的蛋白得率高，纯度高为建立免疫学检测方法提供原材料，具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种重组降钙素原PCT的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1、培养诱导：

LB培养基，1mMIPTG诱导，可溶表达，诱导结束A₆₀₀＝3.498，获得湿菌；

S2、破菌：

在步骤S1中得到的湿菌中加入破菌液，冰浴超声，超声破菌后，取1ml小样，用于电泳；其余样品离心后，上清用于后续分离纯化或-20℃保存；

S3、分离纯化：

S31、疏水层析：选用丁基，辛基或苯基疏水介质，优选丁基，用含0.75M硫酸铵的缓冲液为平衡缓冲液，缓冲液pH7.0-9.0，优选pH8.0；上样后采用无硫酸的相同缓冲液进行梯度洗脱，所选梯度为6CV；

S32、离子交换层析：选用弱阴离子或强阴离子交换介质，优选DEAEFF，进行第二步层析纯化；所需平衡缓冲液A为pH8.0，20mM Tris；洗脱缓冲液B为：pH8.0 20mM Tris+1MNaC；上样后采用梯度洗脱，洗脱条件：0-100％B，6CV洗脱；

S33、组和层析：

S331：装填DEAE FF介质的层析柱，用pH8.0，20mM Tris缓冲液进行平衡，上样后同样缓冲液进行淋洗，随后用pH8.0，20mM Tris+1M NaCl缓冲液进行洗脱，流速5ml/min，梯度洗脱，收集洗脱峰，用3M的硫酸铵调节洗峰峰电导54.2ms/cm。