[发明专利]聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用

说明书

本发明公开了聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用，属于基因工程技术领域。本发明对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，获得了聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与野生型聚磷酸盐激酶1相比，本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活、pH适应性和亲水性都有了显著提高。针对聚磷酸盐激酶1突变体，本发明还构建了聚磷酸盐激酶1突变体的生产菌。本发明的生产菌能够特异性外源表达高活性的聚磷酸盐激酶1突变体，极大丰富了聚磷酸盐激酶1突变体的来源。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。

背景技术

聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，PPK1)由聚磷酸盐激酶基因1编码，是大肠杆菌内负责催化ATP脱磷酸残基形成聚磷酸盐的一种主要激酶。PPK1具有广泛的应用：PPK1利用ATP末端的磷酸基合成长链磷酸基聚合；也可以利用多聚磷酸盐(poly P)末端磷酸基使ADP生成ATP。PPK1还是生产腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、胸腺嘧啶核苷酸(TMP)等产品都会用到的一种酶。

PPK1在应用中存在的主要问题有：PPK1的酶活一般在650U/mg左右，仍有待进一步的提高；并且PPK1对pH控制较为严格，在生产5＇-单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，PPK1和腺苷激酶的最适pH不同但需要混合投料，这进一步影响了PPK1在实际应用中酶活的发挥。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。具体如下：

MGQEKLYIEKELSWLSFNERVLQEAADKSNPLIERMRFLGIYSNNLDEFYKVRFAELKRRIIISEEQGSNSHSRHLLGKIQSRVLKADQEFDGLYNELLLEMARNQIFLINERQLSVNQQNWLRHYFKQYLRQHITPILINPDTDLVQFLKDDYTYLAVEIIRGDTIRYALLEIPSDKVPRFVNLPPEAPRRRKPMILLDNILRYCLDDIFKGFFDYDALNAYSMKMTRDAEYDLVHEMEASLMEPVSSSLKQRLTAEPVRFVYQRDMPNALVEVLREKLTISRYDSIVPGGRYHNFKDFINFPNVGKANLVNKPLPRLRHIWFDKAQFRNGFDAIRERDVLLYYPYHTFEHVLELLRQASFDPSVLAIKINIYRVAKDSRIIDSMIHAAHNGKKVTVVVELQARFDEEANIHWAKRLTEAGVHVIFSAPGLKIHAKLFLISRKENGEVVRYAHIGTGNFNEKTARLYTDYSLLTADARITNEVRRVFNFIENPYRPVTFDYLMVSPQNSRRLLYEMVDREIANAQQGLPSGITLKLNNLVDKGLVDRLYAASSSGVPVNLLVRGMCSLIPNLEGISDNIRAISIVDRYLEHDRVYIFENGGDKKVYLSSADWMTRNIDYRIEVATPLLDPRLKQRVLDIIDILFSDTVKARYIDKELSNRYVPRGNRRKVRAQLAIYDY IKSLEQPE。

本发明通过gromacs对野生型聚磷酸盐激酶1(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行拓扑并分析，定义立方体并填充水分子，得到溶剂化体系，构建盒子，然后在盒子中添加抗衡离子，再在charmm力场下进行能量最小化，然后进行NVT平衡和NPT平衡，再对成品进行1ns的MD模拟，最终将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，得到聚磷酸盐激酶1突变体。