[发明专利]一种高稳定性固定化酶的制备方法

说明书

本发明涉及一种高稳定性固定化酶的制备方法，在按照常规方法制备的粗酶液中加入氨基树脂LXTE‑700S过滤，然后加入硼酸缓冲液、磷酸吡哆醛，震荡反应；最后加入长程交联剂和短程交联剂，震荡反应后抽滤，即获得高稳定性固定化酶；所述环氧基交联剂为长程交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚及短程交联剂丙三醇三缩水甘油醚混合物，本申请提供的固定化酶的制备方法操作简单，可显著延长其储存及使用寿命，在酶催化工业中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种高稳定性固定化酶的制备方法。

背景技术

酶作为重要的催化剂已经在食品、医药化工等领域广泛应用。相较于游离酶，固定化酶具有更好的工艺适应性，即更好的耐热性、试剂耐受性、可方便固液相分离及可回收重复利用等特性。因此，固定化酶已然成为现代工业催化领域中不可或缺的绿色催化剂。

固定化酶制备方法一般包括吸附法、共价结合法、交联法及包埋法。其中，吸附法利用载体与酶分子之间范德华力作用结合，使用过程中容易导致酶的脱落；共价结合法在载体与酶分子之间有共价键的形成，多次使用后酶也不易脱落；交联法则利用蛋白质交联剂，如戊二醛等在酶分子间形成共价键，进而将游离“单体酶”转变成具有三维结构的“多聚体酶”，进而增加酶的稳定性。而包埋法则利用物理包围方式，将酶分子包裹，使其活性中心不被破坏，同时具有相对坚固的机械物理防护。如专利CN113308457 A公开了一种在聚乙烯聚吡咯烷酮保护下，氨基配体与醛基配体反应形成有机骨架将酶分子包埋其中，该操作简单，但制备过程有强致癌化学物质二苯胺的参与，不利于生产应用。

以上现有固定化酶方法因利用原理、工艺各异及制备成本控制要求不同，在不同催化反应中均有规模化应用。但无论采用哪种制备方法，固定化酶的酶分子仍面临稳定性问题，常出现贮存失活，尤为严重的是在一些涉及高浓度有机试剂的重要的医药中间体合成过程随着使用批次增加底物转化率降低显著。

为解决酶失活问题，通常采用通过大量的基础实验，通过筛选不同的固定化方法以确定最优固定方法，如共价结合法中对不同的酶与载体进行固定化适配性优化以改善固定化酶的稳定性。如对选择不同的树脂种类、酶与载体配比等固定化过程进行参数优化。此外，对固定化酶做进一步的化学修饰也可以提高其稳定性。Hadjer Zaak等报道，利用聚乙烯亚胺和戊二醛进一步处理固定化脂酶，发现聚乙烯亚胺及戊二醛均可导致脂酶分子间形成共价键，进而在外围将脂酶分子包裹住，防止酶分子脱落，显著增加了吸附法制备的固定化脂酶的稳定性(Zaak H,Fernandez-Lopez L,Otero C,et al.Improved stability ofimmobilized lipases via modification with polyethylenimine and glutaraldehyde[J].Enzyme and Microbial Technology,2017,106:67-74.)。

生化研究表明，酶分子的空间结构对于酶的活性至关重要。通过定向进化技术对酶分子氨基酸种类进行改造是获得高稳定性酶的有效方法。比如，通过氨基酸的定向突变，改变酶的耐热性或其他抗性。其中，最为经典的是借助带有巯基的半胱氨酸成对的参入增加酶分子内部二硫键稳固酶的结构，进而提高其稳定性。但这种操作目前仍依赖于对蛋白质结构预测及耗时的突变体筛选过程，而且在引入多对二硫键以强化的过程中容易发生二硫键的错配，导致酶活性的大幅降低甚至丧失。中国专利CN 111117996A公开了一种固定化酶、其制备方法及应用，该方法采用聚乙二醇修饰戊二醛或醛基化右旋糖苷，最后形成分散有醛基、羟基的网状结构，通过共价键、离子键等作用力包裹酶，进而提升了酶的机械稳定性。但此过程需要优化醛与聚乙二醇的比例，在聚乙二醇分子上接入活性基团，再与酶蛋白上基团形成共价键，其机械稳定性提升依赖于酶分子间聚合及聚乙二醇大分子与酶分子互作，酶分子自身骨架稳定性仍有较大的提升空间。