[发明专利]一种富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及一种富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法和试剂盒。所述富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法包括以下步骤：1）抽提孕妇血液，以获得血浆DNA；2）对所述血浆DNA进行末端补平和3’悬A，以获得3’悬A后的血浆DNA；3）将所述3’悬A后的血浆DNA与测序接头连接，以获得连接产物；4）将上述步骤3）得到的连接产物和磁珠预混液混匀、磁吸、吸取上清液；5）将上述步骤4）得到的上清液与磁珠混匀、磁吸、弃去上清液；6）对上述步骤5）保留的磁珠进行清洗和洗脱，以获得经富集的胎儿DNA；并且其中所述步骤2）的末端补平和3’悬A在一个反应体系中进行，且所述步骤2）和3）之间不包括纯化步骤。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种富集孕妇血浆中胎儿DNA的方法和试剂盒。

背景技术

血浆DNA又称循环DNA，是血液中的细胞外DNA，长约几十到几百核苷酸。1997年卢煜明教授在怀有男胎的孕妇血浆中检出Y染色体序列¹，由此发现在孕妇血浆中含有游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）片段，从而为无创产前检测（noninvasive prenataltesting,NIPT）提供了理论可能。母体血浆中的游离DNA为胎儿和母体游离DNA的混合物，其中大部分都是母体自身的游离DNA，胎儿DNA仅占总游离DNA的很少部分，约占总游离DNA5%-30%，随着妊娠期不同，胎儿游离DNA比例有所变化，胎儿游离DNA可最早于妊娠4周检出，绝大部分孕妇在妊娠10周胎儿游离DNA量可超过4%。孕妇血浆中的游离DNA具有母源DNA背景高，相对微量的特点。

随着第二代测序技术的发展和逐步成熟，无创伤地直接检测胚胎染色体病成了一个重大的研究课题。染色体病是指由染色体异常引起的疾病，是出生缺陷中最严重的一类疾病，常见的染色体异常包括染色体数目异常（非整倍体）和染色体结构异常（微缺失、微重复等）。目前基于游离DNA的胎儿染色体非整倍体无创产前检测凭借其无创、简便、快速、灵敏度高的特点在临床上广泛应用，受到临床认可。

临床需求不仅限于染色体非整倍体的无创检测需求，还包括对染色体微缺失/微重复(CNV)的无创检测需求。然而，因为染色体微缺失/微重复(CNV)的区域较小，其无创检测难度远高于染色体非整倍体。通常认为胎儿游离DNA占比越高，染色体微缺失/微重复(CNV)越容易被检出，低胎儿游离DNA占比(4%)与检测失败和假阴性结果有关。因此，在无创产前检测中，为了保证低胎源比样本准确检测染色体异常，非常有必要提高所建文库中胎源DNA的占比，来提高胎源DNA信号强度。

孕妇血浆中的母体和胎儿游离DNA以类似于“ladder”的片段模式分布，不同点在于，胎儿游离DNA片段长度偏小：胎儿游离DNA主峰为143bp，仅有20％193bp²，不超过313bp；而母体游离DNA主峰为166bp，部分片段＞300bp³，故可通过DNA片段长度对二者进行鉴别，达到富集胎儿的游离DNA的目的。

目前基于DNA片段长度分离的方法有：

（1）对血浆游离DNA进行电泳富集⁴，电泳富集效率很低，且电泳属于开放式操作，极易造成样品间的交叉污染。