[发明专利]花生组培方法和花生遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种花生组培方法和花生遗传转化方法。其中，该花生组培方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；b)将愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；c)将芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；d)将不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株。该花生组培方法能够解决现有技术中传统花生组培再生方法的再生体系不适宜进行农杆菌转化的问题，适用于花生培育领域。

技术领域

本发明涉及花生培育领域，具体而言，涉及一种花生组培方法和花生遗传转化方法。

背景技术

花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内广泛种植的油料作物和经济作物，种子中含有丰富的脂肪、蛋白、矿物质及维生素，具有很高的经济和营养价值，是我国优质食用油的重要来源。

随着分子生物学的发展，组织培养技术日渐成熟和完善，已经渗透到生物学科的各个领域，为研究植物细胞、组织分化及器官形态建成的规律提供试验条件，在作物的遗传改良过程中发挥重要的。

基因工程育种技术的应用，促进了花生品种选育和改良、适应性筛选鉴定、种质创新和遗传转化的研究，而高效的植株再生体系是开展花生基因工程研究的必要条件之一。花生组培再生方面，经过科学家的不断努力，建立起了花生多种组织、器官的再生体系。20世纪90年代以来，花生再生技术取得了巨大进展，目前在花生组织培养过程中，子叶、幼胚、成熟胚、胚轴、花粉、胚小叶或叶片及茎尖等作为外植体培养诱导获得再生植株。由于受花生基因型、激素类型及各激素比例、培养基成分、外植体类型及生理状态等因素的影响，花生再生体系尚不成熟，不同类型花生组织培养的效率还有待进一步提高。

农杆菌介导法是花生遗传转化最常用的方法之一。由于双子叶植物是农杆菌的天然宿主，80％以上的双子叶植物遗传转化是通过农杆菌介导法进行的。由于农杆菌介导法具有操作简便、一般以单拷贝形式插入外源基因、费用低、遗传稳定性好等优点，该方法成为目前主流、首选的植物遗传转化方法。1994年，印度EaPen首次通过农菌介导法，获得β-葡糖甘酸酶(Gus)活性和抗卡那霉素的转基因花生。乔利仙等以胚小叶为外植体，利用农杆菌介导法，获得了转基因植株。丁霄等和宋汝涛等分别以花生幼叶和子叶为外植体，利用农杆菌介导法，将含木糖异构酶基因的表达载体导入花生，用木糖筛选获得转基因植株。

经过多年的研究，花生组培再生及农杆菌介导遗传转化方面取得了巨大的进展，但还存在诸多问题。花生组培再生方面，大多数为器官直接再生，虽然周期短、成苗快，但该再生体系用于农杆菌介导转化，出现嵌合体多、假阳性高、转化效率低、重复性差、有较强的基因型依赖性。虽然花生愈伤诱导比较容易，但转化成胚性愈伤比较难、成苗率低、发育成正常植株比较困难。因此，建立一种再生率高、适用于不同基因型花生品种、周期短、成熟可靠的花生植株再生和遗传转化体系具有重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种花生组培方法和花生遗传转化方法，以解决现有技术中传统花生组培再生方法的再生体系不适宜进行农杆菌转化的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种花生组培方法，该花生组培方法包括：a)将胚小叶接种至芽丛诱导培养基，培养获得愈伤组织；b)将愈伤组织接种至芽丛诱导培养基，培养获得芽丛；c)将芽丛接种至分化伸长培养基，培养获得不定芽；d)将不定芽接种至生根培养基，培养获得花生再生植株；芽丛诱导培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 3.5～4.0mg/L，NAA 0.65～0.75mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；分化伸长培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，6-BA 4.5～5mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0；生根培养基以MS液体培养基为基础，补充加入蔗糖25～35g/L，NAA 2.0～3.0mg/L，琼脂粉7.2～8.0g/L，pH值5.8～6.0。