[发明专利]一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法

权利要求书

1.一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将烟草土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；

将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24~48h；

将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；

将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养。

2.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，所述侵染液采用50mL OD值(600）0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

3.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，所述发根农杆菌包括A4、R1000、R1601中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，将烟草土培苗的叶片剪成（1~2）cm×（1~2）cm，加入侵染液中，侵染5~10min后，进行共培养。

5.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL头孢的MS固体培养基中，培养2~3周。

6.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，所述诱导培养基组分如下：

20×大量元素母液：NH₄NO₃ 33.0 g，KNO₃ 38.0 g，MgSO₄·7H₂O 7.4 g，KH₂PO₄ 3.4 g；

200×微量元素母液：KI 0.166 g，H₃BO₃ 1.24 g，MnSO₄·4H₂O 4.46 g，ZnSO₄·7H₂O1.72 g，Na₂MnO·2H₂O 0.05 g，CuSO₄·5H₂O 0.005 g，CoCl₂·6H₂O 0.005 g；

200×铁盐母液：FeSO₄·7H₂O 5.56 g，EDTA-Na₂·2H₂O 7.46 g；

200×有机母液：肌醇20.0 g，烟酸0.1 g，VB₆ 0.1 g，VB₁ 0.1 g，甘氨酸0.4 g；

20×钙盐母液：CaC1₂ 6.64 g；

所述诱导培养基的制备方法如下：

组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15 min备用；

MS液体培养基的配制：

20×大量元素母液50 mL，200×微量元素母液5 mL；

200×铁盐母液5 mL，20×Ca盐母液50 mL；

200×有机母液5 mL，调pH到5.8~6.2。

7.根据权利要求1所述的快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，所述烟草土培苗为4周龄土培苗。