[发明专利]一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法

说明书

本发明公开了一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：将烟草土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24~48h，将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，从而获得大量烟草毛状根。本发明提供一种土培苗直接诱导毛状根方法，适用于多种烟草品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过直接诱导烟草土培苗，实现土培苗烟草毛状根快速、高效的诱导和扩繁。

技术领域

本发明涉及一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，属于农业应用生物技术领域。

背景技术

烟草的根系是烟草生长及品质的基础，目前，对烟草根系的研究方兴未艾，但烟草根系在土壤内无法直接了解，如何能够直观的研究根系，是一个难点。烟草毛状根作为人工诱导生成的生物反应器，能直观的观测根的生长，直接对根系进行研究。

目前，对烟草毛状根的诱导，多采用无菌苗的形式。其中，相关文献报道多采用无菌苗进行处理，无菌苗成本较高，且对菌体污染和烟苗生长要求很高，需要相关仪器设备，不利于研究和生产，从而制约了毛状根的诱导效率。近年来，相关文献报道了发根农杆菌(A4、R1000、R1601)可以诱导烟草无菌苗发根，但并未有相关文献报道土培苗可以直接诱导毛状根方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，通过直接诱导烟草土培苗，实现土培苗烟草毛状根快速、高效的诱导，适用于多种烟草品种的毛状根的诱导。

为解决上述技术问题，本发明是采用下述技术方案实现的：

本发明提供一种快速高效的烟草毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：

将烟草土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；

将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；

将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；

将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养。

作为一种优选实施方式，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。

作为一种优选实施方式，所述发根农杆菌包括A4、R1000、R1601中的任意一种。

作为一种优选实施方式，将烟草土培苗的叶片剪成(1～2)cm×(1～2)cm，加入侵染液中，侵染5～10min后，进行共培养。

作为一种优选实施方式，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL头孢MS固体培养基中，培养2～3周。

作为一种优选实施方式，所述诱导培养基组分如下：

20×大量元素母液：NH₄NO₃ 33.0g，KNO₃ 38.0g，MgSO₄·7H₂O 7.4g，KH₂PO₄ 3.4g；

200×微量元素母液：KI 0.166g，H₃BO₃ 1.24g，MnSO₄·4H₂O 4.46g，ZnSO₄·7H₂O1.72g，Na₂MnO·2H₂O 0.05g，CuSO₄·5H₂O 0.005g，CoCl₂·6H₂O 0.005g；