[发明专利]胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引物、探针及其试剂盒和应用

权利要求书

1.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引物和探针，其特征在于，包括：

用于检测第21号染色体非整倍体的Seq ID No.1-40所示核苷酸序列的引物和Seq IDNo.121所示核苷酸序列的探针；

用于检测第18号染色体非整倍体的Seq ID No.41-80所示核苷酸序列的引物和Seq IDNo.122所示核苷酸序列的探针；

用于检测第13号染色体非整倍体的Seq ID No.81-120所示核苷酸序列的引物和SeqID No.123所示核苷酸序列的探针。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端淬灭基团连接；

优选的，所述探针加入了LNA修饰和/或MGB修饰；

优选的，用于检测21号染色体的探针5’端标记为FAM荧光修饰，3’端标记为BHQ1淬灭修饰；

优选的，用于检测18号染色体的探针5’端标记为HEX荧光修饰，3’端标记为BHQ1淬灭修饰；

优选的，用于检测13号染色体的探针5’端标记为ROX荧光修饰，3’端标记为BHQ2淬灭修饰。

3.根据权利要求1或2所述的引物和探针在制备胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的试剂盒中的应用。

4.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液；所述PCR反应液至少包括无核酸酶水、缓冲液Buffer和Taq酶。

6.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

1)对待测样品进行处理，提取脱落细胞DNA或血浆游离DNA；

2)利用权利要求4或5所述的试剂盒以及所述提取的DNA，配制多重数字PCR扩增反应液；

3)将所述反应液置于多重数字PCR设备中，生成液滴并进行PCR扩增、拍照以及数据分析；

4)分别获得FAM、HEX和ROX荧光通道检测结果，分别计算提取的DNA中21、18和13号染色体的拷贝数比值，通过统计学方法判定胎儿是否存在13、18或21号染色体非整倍体疾病。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述待测样品为含有胎儿DNA的样品，如孕周至少5周的孕妇宫颈脱落细胞或孕周至少10周的孕妇外周血，优选为孕周5-8周的孕妇宫颈脱落细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述多重数字PCR扩增反应液中，每对所述引物的终浓度为100-400nM；所述探针的终浓度为100-400nM；

优选的，按总体积25uL计算，所述多重数字PCR扩增反应液配方包括：缓冲液Buffer12.5uL、Taq酶0.6uL、无核酸酶水5-7uL和提取的DNA 1-2.5uL。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)所述多重数字PCR程序为：

95℃预变性10分钟；45个循环94℃变性10秒，58-60℃退火延伸1分钟；98℃酶灭活5分钟；35℃保温。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)所述判定的方法为：

阴性样本的判定：当13、18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在0.95-1.05时，则检测样本不存在13、18或21号染色体的拷贝数变异情况；

阳性样本的判定：当13、18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在1.05-1.5时，则检测样本存在13、18或21号染色体的拷贝数变异情况。