[发明专利]一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系的方法

权利要求书

1.一对用于dCAPS标记区分高异交率大豆雄性不育系方法的引物，其特征在于采用dCAPS分子标记SNP1进行PCR扩增对应的引物：

上游引物序列：5’- ACAGCGACAAAGTAATGGGTCAAGCT -3’；

下游引物序列：5’- TCTCCAAGATTGACGACGAAGG -3’。

2.一种dCAPS标记区分高、低异交率大豆雄性不育系的方法，其步骤详细阐述如下：

1）提取RN型细胞质雄性不育系组织的基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板，采用dCAPS分子标记SNP1进行PCR扩增，对应的引物为：

上游引物序列为：5’-ACAGCGACAAAGTAATGGGTCAAGCT-3’；

下游引物序列为：5’- TCTCCAAGATTGACGACGAAGG -3’；

2）进行PCR扩增，体系为25μL，其中2×PCR MIX 12.5μL，上下游引物各1μL（10μM /μL），模板DNA (10～20 ng/μL) 4μL，无菌去离子水6.5μL；PCR循环条件为94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 40 s，35个循环；72℃延伸5 min；

用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；此PCR产物作为酶切模板；

3）进行PCR产物酶切：

所述的dCAPS标记SNP1对应的酶切体系为20μL，其中加入1μL的HindIII；加入1μL的10倍CutSmart buffer，PCR产物5μL，加入3μL ddH2O；酶切反应程序为37℃孵育15min，然后80℃孵育20min将酶失活；

4）利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物：

琼脂糖凝胶电泳过程：将酶切产物10μL混入2μL的10×溴酚蓝上样缓冲液，然后在配制浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，100V电压，电泳时间为40 min；在凝胶成像仪上记录并分析电泳结果；成像并记录条带数量和大小；通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆RN型细胞质雄性不育系的异交率高、低的区分；高异交率不育系的酶切片段长度为302bp，低异交率不育系的酶切片段为三个，长度分别为302bp、279bp和23bp；其中23bp因为分子量小，在琼脂糖凝胶电泳中肉眼观测不出来，能在琼脂糖凝胶电泳上被肉眼观察到的片段为两个，分别是302bp和279bp。