[发明专利]一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系的方法

说明书

本发明提供了一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系的方法，用于鉴定大豆细胞质雄性不育系异交率的高或者低，将为拓宽大豆CMS种质资源和鉴别高异交率和低异交率不育系提供方便快捷的途径。从高异交率的不育系和低异交率不育系中发现存在的差异SNP，在跨SNP的区域侧翼序列设计引物进行PCR扩增，扩增的产物片段大小通过限制性内切酶酶切可以将高异交率的雄性不育系和低异交率不育系区分出来，条带清晰，重复性好，可靠性强，这种应用基于SNP和内切酶结合的标记可以鉴定出育种过程中高异交率的不育系，为制种过程中高效的选择母本，降低制种成本提供保障。

技术领域

本发明提供了一种dCAPS标记区分（高、低）异交率大豆雄性不育系的方法，尤其是公开了一种利用dCAPS标记区分大豆RN型细胞质雄性不育系异交率高或者低的方法，用于鉴定大豆细胞质雄性不育系异交率的高或者低，属于农作物分子标记检测技术领域。

背景技术

大豆杂种优势利用落后于玉米、高粱、水稻、油菜等大田作物。原因之一是长时间内没有找到避免母本自交的有效机制（张井勇，2018）。利用大豆RN型细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）系，吉林省农业科学院2003育成了世界上第一个大豆杂交种（赵丽梅等，2004）。大豆CMS系统由不育系、保持系和恢复系组成，其中雄性不育细胞质的载体是不育系，到目前为止，利用细胞质雄性不育系，国内已经育成三十余个大豆杂交种，其中利用了大豆RN型细胞质雄性不育系的杂交种超过二十个。

尽管杂交大豆能大幅度提高产量，但是大豆杂交制种技术还没有进行广泛的推广应用，种子的繁殖量为限制因素。此外在大豆杂交种创制过程中，除以不育系作母本同恢复系为父本进行杂交可获得杂交种外，制种还需要繁殖CMS“三系”。其中保持系和恢复系由于自身可育，种子可由自交繁殖获得；而不育系自身不育，种子只能通过其作为母本与同型保持系父本杂交获得。母本异交结实率低，造成制种成本高，选配的优势组合无法利用，仍是制约杂交大豆产业化进程的瓶颈之一，继而影响大豆CMS商业化育种工作（孙寰等，2004）。

发明内容

本发明提供一种dCAPS标记区分（高、低）异交率大豆雄性不育系的方法，利用dCAPS标记区分高、低异交率大豆细胞质雄性不育系，能够鉴别选育出多个稳定不育系是否具有高异交率的性状，作为准确和可靠的分子生物学实验检测技术和手段，能够辅助高效率，低成本，减少用低异交率母本进行配制杂交组合的有效方法。

本发明提供一种dCAPS标记区分（高、低）异交率大豆雄性不育系的方法，解决方案如下：

1）提取含有RN型雄性不育细胞质的不同异交率大豆不育系种子基因组DNA，选用两者间的1对基因组总DNA的SNP衍生出的dCAPS为标记，标记命名为SNP1，其对应的部分侧翼序列为：

TACAGCGACAAAGTAATGGGTCTAGCT[G/G和T的杂合位点][高异交率/低异交率]G[G/C][高异交率/低异交率]AAGCTCATGGAGGTGTTGTCCGAAGCAATGGGGTTAGAGAAAGA；

上述侧翼序列中的G和T的杂合位点是指DNA双链中一条链的位点为G，其对应另一条链上的等位位点为T。

在SNP1的侧翼序列设计一对引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物序列为：5’-ACAGCGACAAAGTAATGGGTCAAGCT-3’；

下游引物序列为：5’- TCTCCAAGATTGACGACGAAGG -3’；

2）扩增后的PCR产物在高异交率不育系和低异交率育不育系中长度是一致的，利用限制性内切酶酶切PCR产物，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，高异交率不育系和低异交率不育系通过观察获得不同长度大小的条带进行准确区分；SNP位点对应的PCR扩增的引物大小、相应的限制性内切酶和酶切后的片段大小等特征如下所述：