[发明专利]一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法

权利要求书

1.一种猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选用满足条件的兔：体重2.25-3.5kg，符合国家规定的清洁级实验动物，且其不带有病原体及其抗体，病原体包括杂菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒、猪流行腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒中的任一种或多种的组合；

(2)免疫原制备：制备猪轮状病毒的病毒液，取上清液经无菌检验、无支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/mL作为活免疫原；

将活免疫抗原，作为灭活免疫原；

(3)免疫接种：分别对每只兔进行5次免疫接种：

第一次免疫接种：对每只兔颈部肌肉注射按1：1混合的2ml的活免疫原和弗氏完全佐剂；

中间4次免疫接种：第一次免疫接种后每隔14天分别对每只兔进行颈部肌肉注射按1：1混合的2ml的灭活免疫原和弗氏不完全佐剂；

(4)采集兔血清:最后一次免疫接种后7-10天采集兔血清检测血清中猪轮状病毒的中和抗体效价和猪轮状病毒抗原，确认兔血清为猪轮状病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即得猪轮状病毒特异性阳性血清。

2.根据权利要求1所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，猪轮状病毒的病毒液的制备步骤为：将猪轮状病毒按0.05～0.1MOI的剂量接种长满单层的MA104细胞，37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时，当CPE达80％或以上时收获病毒液，经冻融三次后，离心去除细胞碎片。

3.根据权利要求1所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，将活免疫抗原灭活包括：在活免疫原中加入BEI，混合均匀后，37℃灭活，加入Na₂S₂O₃溶液过滤除菌，置2-8℃保存。

4.根据权利要求3所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，所述将活免疫抗原灭活包括：在活免疫抗原中加入浓度为0.5mol/L的BEI至浓度为0.005mol/L，混合均匀后，37℃灭活30小时，灭活终止后，加入浓度为1.0mol/L的Na₂S₂O₃溶液至终浓度为0.005mol/L，进行过滤除菌，置2-8℃保存，作为灭活免疫原。

5.一种猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，采用权利要求1～3中任一项所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法制得。

6.根据权利要求5所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒特异性阳性血清的效价在1：320以上。

7.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202222的猪轮状病毒KQ06株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示。

8.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202221，的猪轮状病毒HN01株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。

9.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202191，的猪轮状病毒CH09株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该CH09株的VP4基因序列如SEQ ID NO：2所示，CH09株的VP7基因序列如SEQ ID NO：1所示。