[发明专利]一种低成本生产重组人胰岛素原的方法

权利要求书

1.一种低成本生产重组人胰岛素原的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建人胰岛素原异源表达重组载体，将构建好的所述人胰岛素原异源表达重组载体转入根瘤农杆菌感受态细胞内，得到阳性根瘤农杆菌转化子，将所述阳性根瘤农杆菌转化子制备成根瘤农杆菌菌液；

取里氏木霉Rut-C30制备得到里氏木霉孢子萌发液，将所述里氏木霉孢子萌发液与所述根瘤农杆菌菌液混匀后培养2-3d，得到共培菌液，将所述共培菌液培养5-7d，得到含重组胰岛素原表达盒的潜在里氏木霉转化子；

将所述里氏木霉转化子培养40-50h后，得到里氏木霉转化子T7，选取所述里氏木霉转化子T7中的阳性转化子即里氏木霉INS-GFP；

将所述里氏木霉INS-GFP接种于含工农业废弃物的培养基中发酵培养3-7d后，即于培养基内得到所述重组人胰岛素原。

2.根据权利要求1所述的低成本生产重组人胰岛素原的方法，其特征在于，所述人胰岛素原异源表达重组载体的构建包括如下步骤：从基因库中获取人胰岛素原基因BT006808的序列后按照里氏木霉密码子偏好性优化并在两端设计XbaI和XhoI限制性内切酶序列再合成，得到含有所述人胰岛素原基因BT006808的载体以及含有里氏木霉cbh1基因的启动子、信号肽和终止子的中间载体pUC18-PsT，将所述含有所述人胰岛素原基因BT006808的载体与所述中间载体pUC18-PsT采用XbaI和XhoI限制性内切酶双酶切后回收目的片段并采用T4连接酶连接，得到人胰岛素原异源表达重组载体的基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1；

将所述人胰岛素原异源表达重组载体的基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1的载体pGH-Pcbh1-ins-Tcbh1和含有潮霉素筛选标记的pCAMBIA1300载体质粒分别用EcoRI酶和BamHI酶双酶切后连接得到表达载体Pca-ins，将所述表达载体Pca-ins转化到大肠杆菌后扩增并提取，即得到所述人胰岛素原异源表达重组载体。

3.根据权利要求2所述的低成本生产重组人胰岛素原的方法，其特征在于，所述人胰岛素原异源表达重组载体的基因表达盒Pcbh1-ins-Tcbh1包括第一基因盒和第二基因盒，所述第一基因盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二基因盒的核苷酸序列为两端连有用于同源替换cbh1基因的同源臂的所述第一基因盒。

4.根据权利要1所述的低成本生产重组人胰岛素原的方法，其特征在于，所述转入包括冻融法转入，所述冻融法转入包括如下步骤：将所述人胰岛素原异源表达重组载体与所述根瘤农杆菌感受态细胞混匀后依次冰浴0.3-0.7h、液氮冷冻0.5-1.5min、35-40℃水浴25-35min、冰浴1.5-.2.5min后与LB培养基混匀，得到混合物，将所述混合物于25-30℃、80-120rpm培育2.5-3.5h后于3500-4500rpm离心2-4min再弃上清液，得到混合菌液，将所述混合菌液接种于LB培养基上于25-30℃避光转化2-3天，得到单克隆菌落；

挑取所述单克隆菌落接种于LB液体培养基内于25-30℃、180-220rpm培养45-50h得到根瘤农杆菌转化子。

5.根根据权利要求4所述的低成本生产重组人胰岛素原的方法，其特征在于，所述混合菌液在所述避光转化后还包括鉴定步骤，所述鉴定包括如下步骤：将所述根瘤农杆菌转化子与INSF引物、INSR引物和2x Taq DNA 聚合酶混合后进行PCR，得到PCR产物，将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断所述根瘤农杆菌转化子是否为阳性根瘤农杆菌转化子。